富硒虫草新型饲料的制备

张杰，刘奎艳，范鑫，李洋，张国财

(1.东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2.东北林业大学林学院，哈尔滨 150040)

蛹虫草药性作用温和，具有与冬虫夏草相似的活性成分[1]。因有提高免疫能力、保肺益肾、促进癌细胞凋亡[2]等药效作用而被大规模工业生产。现阶段蛹虫草生产大多采用固体培养模式[3]，当蛹虫草子实体采收后，剩余的培养残基被废弃，而培养残基中仍含有大量的菌丝体和营养成分没有得到很好地利用，造成资源的浪费。动物生产上常用抗生素来预防控制各类疾病，而抗生素的长期大量使用已使病原菌产生耐药性，导致防控疾病效果不佳且给人类健康造成影响[4]。戴朝洲等[5]研究认为，虫草真菌发酵中草药培养基作为原料饲喂育肥猪，能够提高育肥猪的日增重、屠宰率和瘦肉率、降低料肉比和背膘厚度；杨迪[6]研究认为，中草药为绿色安全的饲料添加剂，经过发酵后不但能使有效成分充分释放，提高原料利用率，而且发酵代谢产生的新物质，能增加更丰富的药物作用。而其他虫草饲料添加剂对保育仔猪[7]和巴马小型猪[8]日增重和饲料转化率也具有积极影响，虫草饲料添加剂对猪的免疫增强主要表现在降低腹泻率，提高血液抗体浓度[5]和免疫蛋白的浓度[9]，改善机体抗氧化能力[7]等方面。

硒是人类动物机体生长发育必需的微量元素之一，缺硒时，动物体内细胞抗过氧化物毒性能力降低，细胞被过氧化物破坏，出现水肿、出血，渗出性素质，肝细胞坏死，脾脏纤维性萎缩，肌肉不正常，心肌变性。在饲料原料中添加无机硒或富硒黄粉虫，能有效提高饲料中硒的含量而从根本上解决动物缺硒症状,并且有效提高动物的繁殖性能[10-11]。研究表明，无机硒在肠道吸收是被动的，而类似于硒蛋氨酸等有机形式的硒是主动吸收的,有机硒更有利于血液中硒含量稳定，维持硒在肌肉的沉积量[12]。而黄粉虫中的有机硒相比无机硒(亚硒酸钠)更安全，动物吸收效果更好[13]。此外，黄粉虫还可提供丰富的粗蛋白[14]及粗纤维物质。

本研究利用经采收后的蛹虫草培养残基和富硒黄粉虫，加以豆粕、生物饲料发酵剂进行发酵的方法，制成富硒虫草发酵饲料。通过饲料中各成份含量测量及指标测定，进一步优化饲料配比及培养条件，很大程度上降低了生产成本，为其在饲料工业、养殖行业中规模化应用奠定了基础。

1 材料

1.1 实验对象

蛹虫草培养残基：实验室培养的蛹虫草子实体采收后，剩余的培养残基。

黄粉虫(Tenebriomolitor)：实验室饲养。

1.2 实验药品

环己烷、硝酸、高氯酸、亚硒酸钠、磷酸、考马斯亮蓝G-250、正辛醇、丙酮、氢氧化钾、硫酸、偏钒酸铵、钼酸铵、盐酸、高碘酸钠、醋酸铵、冰醋酸、乙酰丙酮、高碘酸钠、鼠李糖、苯酚。

1.3 实验试剂

DAN 试剂(1.0g/L)：此试剂在暗室内配制。称取DAN(纯度95%～98%)200mg加入带盖锥形瓶中，加入0.1mol/L 盐酸200 mL，振摇约15min使其全部溶解。加入约40mL环己烷，继续振荡5min。将此液倒入塞有玻璃棉(或脱脂棉)的分液漏斗中，待分层后滤去环己烷层，收集DAN溶液层，反复用环己烷纯化直至环己烷中荧光降至最低时为止(约纯化5～6 次)。将纯化后的DAN溶液储于棕色瓶中，加入约1cm厚的环己烷覆盖表层，至冰箱内保存。必要时在使用前再以环己烷纯化一次。

EDTA溶液(0.2mol/L)：称取EDTA二钠盐37g，加水并加热至完全溶解，冷却后稀释至500mL。

考马斯亮蓝G-250溶液：称取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%乙醇后，加入100mL 85%磷酸，并用水稀释至1000mL，过滤制得考马斯亮蓝G-250溶液，避光待用。

钒钼酸铵显色剂：取偏钒酸铵1.25g，加200mL水，加热溶解，冷却后再加入250mL硝酸，另取钼酸铵25g，加水400mL，加热溶解，在冷却条件下，将两种溶液混合，用水定容至1L，避光保存。

高碘酸钠试剂：将0.015mol高碘酸钠溶于1000mL 0.12mol/L的HCL溶液中。

Nash试剂：称取150g醋酸铵，加3mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，加水定容至1000mL。

2 方法

2.1 蛹虫草培养残基处理

选用实验室中培养蛹虫草子实体采收后的剩余培养残基，在60℃烘箱中烘干后，用粉碎机进行粉碎。

2.2 黄粉虫富硒饲养

2.2.1 黄粉虫饲养。选取黄粉虫幼虫(身长约2cm)，饲喂自配饲料，饲养温度约为21～23℃，筛粪频率5～7 天/次。黄粉虫饲料配方：麦麸70%，玉米粉24%，大豆粉5%，奶粉1%。在黄粉虫饲料中分别添加三组不同含量无机硒，分别为Se1=15mg/kg，Se2=25mg/kg，Se3=30mg/kg。无机硒采用亚硒酸钠，将其溶于水中，与饲料搅拌均匀。

2.2.2 硒含量测定。分别取已富硒饲养10、20、30d的黄粉虫，饥饿3d，速冻致死后，在80℃条件下烘干，密封保存备用。取0.5g样品，采用二胺基萘荧光光度法，参照GB/T 13883-2008测定硒含量。

2.3 富硒虫草饲料的制作

2.3.1 不同原料配比的饲料发酵实验。蛹虫草培养残基和黄豆豆粕共100g，两者配比分别为培养残基60g、豆粕40g，培养残基70g、豆粕30g，培养残基80g、豆粕20g，培养残基90g、豆粕10g，培养残基100g，豆粕0g。各添加10g富硒黄粉虫(硒含量为0.3mg/kg)，用100mg/kg的生物饲料发酵剂进行发酵，水分为30%左右。密封发酵5～7d，避免阳光直射。

2.3.2 不同富硒方式的饲料发酵实验。本实验分3组：

第一组(不添加硒)：90g蛹虫草培养残基，10g黄豆豆粕。分别用60、80、100mg/kg的生物饲料发酵剂进行发酵，水分为30%左右。密封发酵5～7d，避免阳光直射。

第二组(有机硒)：90g蛹虫草培养残基，10g富硒黄粉虫(硒含量为0.3mg/kg)，10g黄豆豆粕。分别用 60、80、100mg/kg的生物饲料发酵剂进行发酵，水分为30%左右。密封发酵5～7d，避免阳光直射。

第三组(无机硒)：90g蛹虫草培养残基，亚硒酸钠(调整硒含量为0.3mg/kg)，10g黄豆豆粕。分别用 60、80、100mg/kg的生物饲料发酵剂进行发酵，水分为30%左右。密封发酵5～7d，避免阳光直射。

2.4 富硒虫草饲料中主要物质含量测定

2.4.1 粗蛋白含量的测定。称取0.3g样品，置于预冷的研钵中，分次加入5mL预冷的0.1mol/L(pH=7)磷酸缓冲液，研磨后转入离心管中，12000r/min离心10min，上清液为样品提取液。采用考马斯亮蓝G-250染色法测定粗蛋白含量。

2.4.2 粗纤维含量的测定。将饲料在60℃干燥箱中烘干2h，用粉碎机磨成粉末。粗纤维含量的测定参照GB/T 5009.10-2003。

2.4.3 总磷含量的测定。总磷含量的测定采用钼酸铵分光光度法，参照GB11893-89。

2.4.4 铜含量的测定。铜含量的测定采用原子吸收光谱法，参照GB/T13885-2017。

2.4.5 水分含量的测定

预处理：称取10g饲料，在130℃干燥箱中烘干10min，烘干结束后，于室温下冷却2h以上，然后用粉碎机粉碎。

称取5g已粉碎好的试样，采用直接干燥法参照GB/T 6435-2014，通过试样干燥损失的质量计算水分含量。

2.4.6 虫草酸含量的测定。取饲料于60℃干燥箱中烘干2h，采用比色法测定虫草酸含量[15]。

2.4.7 虫草多糖含量的测定。取饲料于60℃干燥箱中烘干2h，称取烘干后样品0.50g，加入20mL水，在微波炉中以中火(P50)处理3.5min(将瓶塞放在瓶口上，但不要塞紧)。将处理过的样品溶液过滤，取5mL滤液加入50mL离心管中，采用乙醇沉淀法提取虫草多糖、硫酸-苯酚法[16]测定多糖含量。

2.5 添加不同剂量生物饲料发酵剂的饲料中pH测定

称取10g发酵好的饲料，加100mL蒸馏水，放入4℃冰箱中保存，浸泡24h后取出。过滤取得滤液，用pH计测量滤液的pH值。

3 结果与分析

3.1 黄粉虫饲养的最适硒添加量及最适饲养天数

在黄粉虫饲料中添加亚硒酸钠(硒含量分别为Se1=15mg/kg，Se2=25mg/kg，Se3=30mg/kg)，当饲养时间为10、20、30d时，取黄粉虫测定富硒量，结果如表1所示。

表1 不同硒添加量的黄粉虫富硒量

由表1可知，黄粉虫富硒量随着添加的无机硒浓度的增高而增加，富集量也与时间呈正相关。从时间上来看，在富硒饲养10d时，体内已富集一定量的硒且前10天的富硒速度最快。在饲养20d时，幼虫富硒量明显多于第10d。在饲喂30d时，富硒量仍有增加，但富硒速度减慢。黄粉虫幼虫在饲养30天后大多数发育为成虫，硒含量大大下降。从硒添加量上来看，黄粉虫幼虫富硒范围局限于15～30 mg/kg的硒添加量，添加量过低时富硒量不明显,过高则会引起幼虫大量死亡。当硒的添加量为30mg/kg，饲养天数为30d时，黄粉虫幼虫体内富集的硒含量最高为8.95mg/kg，且没有发现幼虫富硒量下降现象。因此该实验硒的最适添加量为30mg/kg，最适饲养天数为30d。

3.2 饲料主要原料的最佳配比

图1 不同原料配比对饲料中虫草多糖的影响

图2 不同原料配比对饲料中虫草酸的影响

图3 不同原料配比对饲料中粗蛋白的影响

图1～图3中a、b、c、d、e分别表示饲料中蛹虫草培养残基和黄豆豆粕的配比，分别是培养残基60g、豆粕40g，培养残基70g、豆粕30g，培养残基80g、豆粕20g，培养残基90g、豆粕10g，培养残基100g，豆粕0g。可知，饲料中蛹虫草培养残基的量越多，饲料中虫草多糖及虫草酸含量越高，而粗蛋白含量越低。当饲料中不添加黄豆豆粕时，饲料的粗蛋白含量不符合国家标准。因此，可得出饲料中蛹虫草培养残基和黄豆豆粕的最佳配比是培养残基90g，豆粕10g。

3.3 虫草饲料中主要成分的测定结果

3.3.1 硒含量的测定结果

图4 不同生物饲料发酵剂添加量对3组饲料含量的影响

图4中图示1、2、3，分别表示第一组、第二组、第三组饲料。由图中可知，第一组饲料的硒含量小于第二组、第三组饲料的硒含量，且差值较大。第一组饲料硒含量最大值为0.08mg/kg，第二组和第三组饲料的最大值分别为0.343mg/kg和0.372mg/kg。猪饲料的国家标准硒含量为≦0.5mg/kg。3组饲料硒含量均符合国家标准。因此，在饲料原料中添加无机硒或富硒黄粉虫，能有效提高饲料中硒的含量。而黄粉虫中的有机硒相比无机硒(亚硒酸钠)更安全，动物吸收效果更好。

3.3.2 水分测定结果

图5 不同生物饲料发酵剂添加量对3组饲料水分含量的影响

由图5可知，三组饲料的水分含量差值不大，最大值为11.4%。猪饲料的国家标准水分含量为≦11.5%，3组饲料水分含量均符合国家标准。饲料的水分含量与发酵时加水量有关，发酵时使原料的水分含量保持在30%左右，发酵后的饲料水分含量较适宜。

3.3.3 粗纤维含量测定结果

图6 不同生物饲料发酵剂添加量对3组饲料粗纤维含量的影响

由图6可知，第二组饲料中粗纤维含量明显高于其它两组，而第一组和第三组饲料的粗纤维含量相差不大。第二组饲料中粗纤维含量的最大值为52mg/g。猪饲料的国家标准粗纤维含量为<7%，3组饲料粗纤维含量均符合国家标准。第二组饲料加入了富硒黄粉虫，使饲料的粗纤维含量提高。因此，饲料中添加黄粉虫可增加粗纤维含量。

3.3.4 粗蛋白含量测定结果

图7 不同生物饲料发酵剂添加量对3组饲料粗蛋白含量的影响

由图7可知，第二组饲料的粗蛋白含量高于其它两组，粗蛋白含量最大值为140.8mg/g。第一组和第三组饲料粗蛋白含量最大值分别为118.8mg/g和115.1mg/g。猪饲料的国家标准粗纤维含量为≧13%，只有第二组饲料的粗蛋白含量符合国家标准。第二组饲料添加的黄粉虫的蛋白质含量较高，提高了第二组饲料的粗蛋白含量。因此，饲料中添加黄粉虫可增加蛋白质含量。

3.3.5 铜含量测定结果

图8 不同生物饲料发酵剂添加量对3组饲料铜含量的影响

由图8可知，3组饲料中铜含量差值不大，铜含量最大值为12.08mg/kg。猪饲料的国家标准铜含量为≦35mg/kg，3组饲料铜含量均符合国家标准。

3.3.6 总磷含量测定结果

图9 不同生物饲料发酵剂添加量对3组饲料总磷含量的影响

如图9所示，3组饲料中总磷含量差值不大，最小值为6.8mg/g，最大值为8mg/g。猪饲料的国家标准总磷含量为≧0.35%，3组饲料总磷含量均符合国家标准。

3.3.7 虫草酸含量测定结果

图10 不同生物饲料发酵剂添加量对硒虫草饲料虫草酸含量的影响

由图10可知，3组饲料中虫草酸含量无明显差异，最大值为19.37mg/g。在蛹虫草子实体采收后，蛹虫草培养残基中仍含有一定含量的虫草酸，经过生物饲料发酵剂的发酵，饲料中含有虫草酸，可使饲喂的动物提高免疫力，使动物具有良好的生长性状。

3.3.8 虫草多糖含量测定结果

图11 不同生物饲料发酵剂添加量对3组饲料虫草多糖含量的影响

由图11可知，3组饲料中虫草酸含量无明显差异，最大值为28.47mg/g。

3.3.9 pH值测定结果

图12 不同生物饲料发酵剂添加量对3组饲料pH的影响

pH能反应饲料是否得到了很好的保存及其被腐败菌分解的程度，饲料的pH越低，品质越优良。由图12可知，3组饲料中，当生物饲料发酵剂的添加量为100mg/kg时，pH都达到最低。因此，生物饲料发酵剂的最适添加量应为100mg/kg。

4 结论

按不同原料配比(60g培养残基、40g豆粕，70g培养残基、30g豆粕，80g培养残基、20g豆粕，90g培养残基、10g豆粕，100g培养残基、0g豆粕)，以饲料中虫草多糖、虫草酸和粗蛋白含量为指标，确定饲料的原料最佳配比为90g蛹虫草培养残基，10g黄豆豆粕和10g富硒黄粉虫(硒含量为0.3mg/kg)。再按不同富硒方式、不同量(60、80、100mg/kg)生物饲料发酵剂进行发酵实验，确定了生物饲料发酵剂的最佳添加量为100mg/kg。也就是说，本研究新研发的富硒虫草饲料的最佳配方为：90g蛹虫草培养残基，10g黄豆豆粕和10g富硒黄粉虫(硒含量为0.3mg/kg)，生物饲料发酵剂含量100mg/kg。此时，饲料中硒、粗蛋白、粗纤维、总磷、铜、水分含量均符合猪饲料国家标准含量，明显看出采用富硒黄粉虫的有机富硒方式的优点，且保留了一定量的蛹虫草活性物质(虫草多糖含量为28.47mg/g，虫草酸含量为19.37mg/g)，在饲料工业、养殖业领域均有广阔的应用前景和经济价值。