提取骨碎补中柚皮苷的研究

张智，杨柳，尹文哲，高群

(1.东北林业大学，哈尔滨 150040；2. 哈尔滨医科大学，哈尔滨 150086)

骨碎补是水龙骨科(Polypodiaceae)植物槲蕨 [Drynariafortunei(Kunze) J. Sm.]的干燥根茎[1]，为常用中药，现已明确规定可以用于保健食品。骨碎补中的柚皮苷和新北美圣草苷含量较高，为骨碎补中的主要活性成分。现代研究[2-5]表明柚皮苷作为骨碎补主要活性成分，在提高成骨细胞的增殖、分化方面起到主要作用。目前对于RDN(即骨碎补中的柚皮苷)的提取工艺尚未有系统化的研究，本文旨在采用超声协同复合酶法，研究响应面优化RDN的提取工艺，酶解法能够加速活性成分的溶解和释放，超声波产生的空化作用、机械作用、热作用可以从整体上提高提取过程的传质速率和效果，从而可以大大提高RDN的提取量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

骨碎补，购于药店市售。柚皮苷标准品(≥98%)，抗坏血酸(≥98%)，1,1-二苯基-2-苦肼基，水杨酸，FeSO4，邻苯三酚，铁氰化钾，FeCl3等均为分析纯。纤维素酶(1.4×106U/g)和果胶酶(1.0×105U/g)北京博奥拓达科技有限公司。

1.2 设备

YP2001N型电子天平，上海精天电子仪器厂；UV-5500PC紫外可见分光光度计， 上海元析仪器有限公司；722S可见分光光度计，上海精科仪器有限公司；KQ-300DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

将骨碎补原料清洗干净，低温干燥至恒重后粉碎为60目粉末，在pH4.6的条件下以1∶1的比例加入纤维素酶和果胶酶共9mg/g于50℃水浴中酶解90min，得到骨碎补酶解液。

1.3.2 RDN的测定方法及标准曲线的绘制

RDN的测定方法参照Davis分光光度法[6]。以柚皮苷质量浓度X(mg/L)为横坐标，吸光度值Y(A)为纵坐标，绘制柚皮苷标准曲线图，并计算回归方程。

1.3.3 RDN的提取过程及得率的计算

Y=(C×V×N)/M

式中：Y—柚皮苷提取量，mg/g；C-柚皮苷质量浓度，mg/mL；V-溶液体积，mL；N-稀释倍数；M-骨碎补干粉质量，g。

1.3.4 单因素试验

准确称取骨碎补粉末2.00g，按1.3.1方法处理后，分别考察在以下不同的超声时间(10、20、30、40、50min)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 )、乙醇浓度(40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%)、超声温度(40、50、60 、70、80℃)条件下提取RDN的得率。

1.3.5 响应面优化试验

在单因素试验基础上，运用 Design-Expert 软件，根据 Box-Behnken 中心组合试验设计原理[7]，以超声温度、超声时间、乙醇浓度、料液比作为自变量，以RDN的提取量为响应值设计响应面优化试验，设计试验方案如表1。

表1 因素水平表

1.3.6 数据分析

采用 Excel、SPSS 20.0软件和Origin 8.5.1对数据进行分析(显著性界值为p<0.05，极显著性界值为p<0.01)。

2 结果与分析

2.1 RDN的标准曲线

柚皮苷标准曲线如图1所示，分析得到回归方程为Y=0.0047X+0.009，相关系数R2=0.9981，结果表明，柚皮苷质量浓度在0～200mg/L范围内线性关系良好。

图1 RDN标准曲线

2.2 超声波提取RDN的单因素试验结果

图2 超声温度对RDN提取量的影响

由图2可知，RDN提取量随着超声温度的升高先升后降，可能是由于提取温度的升高加速了乙醇挥发而降低固液比所致。还可能是因为在浸提过程中高温破坏了有效成分，从而导致溶解受阻，浸提量反而减小。

图3 超声时间对RDN提取量的影响

由图3可知，RDN提取量随着超声时间的推进呈先升后降的趋势。这可能是由于细胞中有更多杂质溶出，影响溶剂极性，导致RDN得率下降，而且与空气接触时间过长，一部分RDN有可能已经被分解。

图4 乙醇浓度对RDN提取量的影响

由图4可知，当乙醇浓度<65%时，RDN提取量随着乙醇浓度的增大呈现先上升后下降的趋势；在乙醇浓度为55%时，RDN提取量达到最大值，可能原因是RDN在浓度为55%的乙醇溶液中传质阻力较小，溶解度较大；在乙醇浓度为70%时，RDN二次增大，可能是因为此时的溶剂极性很大，由于RDN具有一定的极性，根据相似相容原理，柚皮苷在此时的溶解性很大，从而导致RDN提取量较大。但高浓度的乙醇易于发挥从而造成乙醇的损失，降低固液比，也不利于RDN的提取。

图5 料液比对RDN提取量的影响

由图5可知，液料比由1∶5到1∶25时，随着液料比的升高，RDN的提取量显著增加，在料液比为1∶20的条件下经过一个小幅度的减少后，在料液比达到1∶25时，RDN的提取量达到最大值。这说明液料比在1∶5到1∶25之间时，料液接触不够充分而且柚皮苷在乙醇溶剂中的溶解还没有达到饱和，随着溶剂的增多，料液接触更充分，有效成分进一步溶出。当料液比增加到1∶25时，浸提量达到了最大值。继续增加液料比时，提取量逐渐变小反而明显下降，可能原因是随着溶剂体积变大，RDN的浸提量已不再增加，使得提取液被稀释。

2.3 响应面优化试验结果

表2 响应面分析试验结果

响应面优化试验结果如表2，根据软件获得二次回归数学模型为：

Y=15.20.11A+0.66B-0.51C-0.48D-0.46AB+0.038AC+0.081AD-0.11BC+8.669E-003BD+0.65CD-1.52A1.31B0.96C1.60D2

从图6三维响应图中可以直观地看出各因素之间的交互作用对响应值的影响。

由响应面预测模型预测的最佳提取条件结合实际，响应面预测的最优条件为：先酶解，然后以1∶24的料液比，乙醇浓度55%，70℃，500W，超声32min，此时RDN提取量15.07mg/g。

a.超声温度和超声时间

b. 超声温度和乙醇浓度

c. 超声温度和液料比

d. 超声时间和乙醇浓度

e. 乙醇浓度和酶解温度

f. 液料比和乙醇浓度图6 两因素交互作用对RDN提取量的响应面

3 结论

在提取RDN方面得到了可使RDN的提取量达到15.07mg/g的最佳工艺条件，与之前进行的只用酶法提取或只用超声波法提取相比均大幅提高了提取率，也较之相关报道的[8]研究方法，较大地提高了RDN的提取量，这可能是因为酶和超声波的共同作用将细胞壁破坏，使得胞内物质得以快速释放进而使得更多的柚皮苷被地检测出来。虽然骨碎补被纳入可用于保健品的名录中，但目前对于骨碎补的开发与研究大多还是在医药方面[9-11]。本文系统完善地提供了RDN提取工艺要点，对骨碎补进行研究,对于充分开发利用我国丰富的植物资源，促进深加工相关产业的发展进而取得显著的经济效益和社会效益具有重要的意义。