白细胞介素37/Smad3在兔腹主动脉粥样硬化斑块中的表达研究

陈少源 方红城 黄于朗 林小龙 刘荣志 方叶青 谢培益

518052 广东医科大学附属深圳南山医院心血管内科(陈少源、林小龙、刘荣志、方叶青、谢培益)；518104 广州医科大学附属深圳沙井医院心血管内科(方红城)；518067 中南大学湘雅二医院深圳医院心血管内科(黄于朗)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是临床上最常见的血管疾病之一。AS斑块中存在多种炎症细胞和因子[1]。促炎因子与抗炎因子是重要的影响因素，两者在特定情况下可相互影响。研究表明，炎症反应中单核细胞、淋巴细胞、树突状细胞的激活及其释放的细胞因子(如基质金属蛋白酶9、白细胞介素18等)对促使AS斑块的不稳定、破裂起着重要的作用[2-3]。新近研究发现，白细胞介素37(interleukin 37，IL-37)有抑制固有免疫应答的作用[4]。IL-37能降低促炎因子的产生，其增加与多种慢性病及自身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、肝炎、类风湿关节炎等[5]。研究显示，AS斑块的泡沫样细胞表达IL-37，提示IL-37可能对AS产生保护作用。而Smad3是参与AS的炎症信号的重要通路之一[6]。IL-37参与AS的过程可能与Smad3有关，但相关研究较少。本研究通过兔腹主动脉AS模型检测IL-37/Smad3的表达，探讨它们对AS的影响，并评估阿托伐他汀对AS斑块中IL-37/Smad3表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

20只纯种新西兰雄性大白兔购自并饲养于中山大学动物实验中心[实验动物许可证号：SYXK(粤)2017-0081]。动物房温度保持(22±2)℃，相对湿度保持在40%～60%，日照时间8：00～20：00。实验前3 d灌服阿司匹林6 mg/kg。实验动物按随机数字表法分为3组：对照组(4只)：球囊损伤兔腹主动脉后普通饮食喂养12周；实验组(8只)：球囊损伤兔腹主动脉后给予高脂饲料(1%胆固醇、5%蛋黄、5%猪油、89%标准饲料，每天120～140 g/只)喂养12周；药物组(8只)：与实验组动物同时、同条件下建立AS模型，高脂喂养6周后改为普通饮食并给予阿托伐他汀1 mg·kg-1·d-1，再喂养6周。3组动物在建模当天、喂养6周和12周检测血脂和IL-37，12周时静脉注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉处死取腹主动脉行相关检查。本研究符合中山大学生物医学伦理要求，经医院伦理委员会审核通过。

1.2 血清学检查

血液经2000 r/min离心20 min获得血清。通过全自动血液化学分析仪分析，检测血清中总胆固醇(cholesterol， TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol， LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol， HDL-C)和三酰甘油(triglyceride， TG)的水平。计算动脉粥样硬化指数(atherosclerosis index，AI)。AI=(TC-HDL-C)/HDL-C。酶联免疫吸附实验测定血清IL-37，按试剂生产商(Cat Rapidbio)使用说明进行实验。

1.3 苏木素-伊红(HE)染色

超薄切片机对石蜡包埋组织块进行切片、固定于载玻片上。在室温下过夜干燥，然后进行染色。

1.4 免疫组化及免疫荧光分析

甲醛固定腹主动脉，用抗IL-37和Smad3的多克隆抗体，行IL-37和Smad3免疫染色。3组腹主动脉的脂纹病变通过用苏丹Ⅲ或肉眼观察染色鉴定。所有抗体来自Abcam公司(ab57187)。

1.5 蛋白质印迹法(Western blot)检测

取适量RIPA裂解液匀浆组织，测蛋白浓度后，各样品取50 μg的总蛋白。蛋白在10%的聚丙烯酰胺凝胶中分离，把蛋白转移至孔径0.1 μm的硝酸纤维素膜上。非特异性结合蛋白用含5%的脱脂牛奶缓冲溶液(TBS： 40 mM Tris，300 mM NaCl，pH 7.6)进行室温下封闭1 h，随后膜在TBST洗涤后加入BCL-2抗体(Abcam)孵育。兔源Smad3抗体和IL-37抗体购自Zymed Laboratories(51-1500)及Abcam公司(ab57186)。

1.6 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测

用aRNeasy试剂盒提取新鲜外周血细胞RNA。通过放大转录内参基因(GAPDH)定量RT-PCR的cDNA。以下为特异引物：兔IL-37上游引物是5’-TCACCGAGAAGGAGCAAGCA-3’；IL-37下游引物是5’-ACGGGTTCACCAGAAGAGCA-3’。兔Smad3上游引物是5’-AGACCAGCGACCAGATGAAC-3’；兔Smad3下游引物是5’-AGTAGGAGATGGAGCACCAGAAT-3’。GAPDH利用下列引物进行分析：编码链：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；反义链：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。定量PCR应用ABI PRISM 7900测序系统(Applied Biosystems)。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 3组的体重和生化指标

实验期间，无实验动物死亡。与实验组、药物组相比，对照组的体重在6～12周时增加明显。药物组经阿托伐他汀处理后体重下降。实验组的血脂和AI较对照组明显升高(均为P<0.05)，而药物组在6周后各项指标恢复正常，见表1。

2.2 3组的血清IL-37的表达水平

对照组中IL-37无明显增加。实验组IL-37表达量从基线到12周逐渐增加。与实验组相比，药物组IL-37的表达明显降低(均为P<0.05)，见表2。

2.3 3组的血管病理形态学

对照组的腹主动脉管腔规则，内膜完整光滑，内弹力板连续，中膜平滑肌细胞呈梭形、排列规整。实验组的腹主动脉可见典型的AS形成，向管腔内隆起的斑块表面内皮细胞缺失，内弹力板增厚、断裂，大量的脂肪细胞积于内膜，使内膜变厚，而中膜受压变薄，管腔狭窄不规则；染色质边聚，胞质内有大小不等的脂质空泡形成。药物组的腹主动脉同样可见AS形成，内皮细胞缺失，内弹力板增厚，可见脂肪细胞及脂质空泡形成，内膜、肌层明显变厚及管腔狭窄，但对比模型组泡沫细胞明显减少，管腔狭窄程度有所减轻，见图1。

2.4 3组腹主动脉中IL-37和Smad3的表达水平

泡沫化损伤及高脂饮食在腹主动脉中引起AS斑块，实验组发现大量的泡沫细胞和巨噬细胞聚集，药物组的泡沫细胞和巨噬细胞聚集减少。实验组炎症细胞中IL-37的表达最高，药物组的表达量明显降低，而对照组最低(图2)，3组间的Smad3的表达相似，实验组表达最高，药物组明显降低，而对照组最低(图3)。

表1 3组间体重、血脂和AI比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与实验组比较，bP<0.05；与基线比较，cP<0.05；与6周比较，dP<0.05

表2 3组间血清IL-37表达水平比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与实验组比较，bP<0.05；与基线比较，cP<0.05；与6周比较，dP<0.05

图1 3组血管病理学形态

2.5 3组IL-37和Smad3在AS斑块中的表达水平

处死动物后在AS斑块中发现，IL-37、Smad3在实验组中表达最高，药物组稍低，而对照组表达最低(P<0.001)。Western blot结果提示，IL-37与Smad3呈高度直线相关(r=0.929，P<0.001)；RT-PCR结果提示，IL-37与Smad3亦呈高度直线相关(r=0.942，P<0.001)，见表3。

图2 3组腹主动脉IL-37的免疫组化

3 讨论

图3 3组腹主动脉Smad3的免疫组化

AS主要特征是动脉内壁细胞、LDL-C、细胞外基质的堆积，而多种炎症标记物可在AS斑块中表达[7]。IL-37是新近发现的具有抗炎作用的白介素家族成员，在AS发生、发展中有特殊的作用。研究发现，IL-37参与免疫调节的重要过程[2， 8-9]。IL-37的增加可能是结果而非AS的促炎细胞因子[10]。Smad3是一种抗炎信号通路转化生长因子β。在IL-37过表达的A549细胞中，活化刺激反应可降低与IL-37结合磷酸化Smad3[5]，提示Smad3参与IL-37的调控。本实验发现，实验组血清IL-37水平较对照组明显上升，阿托伐他汀干预可降低其水平，但仍比对照组升高。在第12周时，Western blot和RT-PCR实验结果表明IL-37与血清中的变化相一致。故IL-37可能参与AS过程。IL-37可能依赖激活的腺苷酸激活蛋白激酶的平衡促炎反应，亦可直接抑制免疫细胞的炎症反应。Boraschi等[11]发现IL-37在狼疮患者的单核细胞中表达显著升高。本研究发现，IL-37在血管内皮细胞、特别是斑块处出现明显的巨噬细胞和泡沫细胞富集。免疫组化结果也显示，在巨噬细胞和泡沫细胞的细胞质出现IL-37的聚集，均提示IL-37与AS密切相关。

研究发现，他汀可明显降低AS炎症程度，且降低循环中炎症标记物水平[12-13]。本研究显示，阿托伐他汀治疗后IL-37较实验组呈下降趋势，但仍比对照组高。阿托伐他汀减少IL-37在AS斑块中的表达，机制是在细胞水平上抑制了树突状细胞和巨噬细胞的活化[14]；或在分子水平上抑制了促炎因子分泌。IL-37的降低可能是抗炎因子作用或是一种附带现象，目前尚未明确。IL-37在疾病不同发展阶段呈动态变化，故不同检测时间可能影响血清IL-37水平[9]。

表3 3组间AS斑块中IL-37和Smad3的表达水平

注：与对照组比较，aP<0.05；与实验组比较，bP<0.05

此外，IL-37可通过改变Smad3的表达影响AS过程[8，11]。本研究发现，在斑块的泡沫细胞和内皮细胞的细胞质中，IL-37和Smad3表达呈同步上升，相关性分析提示二者高度相关，提示Smad3的活化可能与IL-37密切相关，而阿托伐他汀能同步抑制IL-37/Smad3表达。

本研究存在一定局限性：由于实验动物为兔，其为草食性动物，对照组在实验过程中采用普通饮食体重逐步增加，而实验组和药物组随着时间延长，高脂饮食特别是他汀类药物气味等因素可能影响其食欲或其生长，故可对体重产生一定影响，影响实验结果。总之，IL-37和Smad3在AS斑块中表达增高，IL-37/Smad3可能参与AS的调节过程，阿托伐他汀可降低IL-37/Smad3的表达。

利益冲突：无