天津博物馆文物库房部分文物与囊匣中霉菌的分离与鉴定

张艳红，刘自军，刘根亮，李 彬，潘 皎，马清林

(1． 天津博物馆，天津 300201； 2． 分子微生物学与技术教育部重点实验室(南开大学)，天津 300071； 3． 南开大学生命科学学院微生物系，天津 300071； 4． 山东大学文化遗产研究院，山东济南 250100 )

0 引 言

馆藏文物中的书画、古籍、纺织品和竹木漆器等有机质文物，常常遭受霉菌的破坏。霉菌在生长代谢过程中产生的有机酸会使文物材料遭到酸腐蚀，且代谢产物可能污染文物表面形成单一色或混合色的霉斑；有机质文物材料作为营养基被微生物分解，使文物机械强度显著下降，这是文物遭到破坏的原因之一。丝状真菌通过发达的菌丝体覆盖文物，并向文物内部渗透吸收营养，对文物造成机械破坏[1]。对文物表面霉菌的鉴定与研究是文物保护工作的重要内容，也是实施有效防治措施的基础。例如，马淑琴[2]对发霉书画文物做实验分析，发现霉菌种类有黑曲霉、黄曲霉和绿色木霉等；唐欢等[3]采集的书画污染霉菌有曲霉属，如黑曲霉、黄曲霉和米曲霉。申艾君等[4]对馆藏竹木漆器文物表面霉斑进行实验研究，鉴定出曲霉属和脉孢菌属等霉菌。2016年初，天津博物馆文物库房的部分有机质文物中有明显的菌斑出现，针对这些霉菌进行采样、培养、分离与鉴定，以期为今后的防治工作提供依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1培养基 霉菌的分离纯化使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 L，自然pH(配完培养基后不用调节pH，PDA培养基的自然pH为7.0左右)。

1．1．2主要试剂 50 mol/L Tris-HCl(pH 8)，10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，苯酚，氯仿，异丙醇，无水乙醇等购自北京伊诺凯科技有限公司。RNaseA(TakaRa)，Transtaq-T DNA聚合酶等购自大连宝生物工程公司。Trans 2K Plus DNA标记，10×PCR缓冲液，6×DNA Loading缓冲液等购自北京全式金生物技术有限公司。

1．1．3主要仪器 DL-CJ-1NDII型超净工作台(苏州净化设备有限公司)；HVA-85型高压灭菌锅(日本HIRAYAMA)；Nikon ECLIPSE 80i型生物显微镜；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；电热培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；全温恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)；PCR扩增仪(Mastercycler gradient，Eppendorf公司)；凝胶成像仪(ChemiDocTM XRS，Bio-Rad公司)等。

1．2 方法

1．2．1样品采集 天津博物馆文物库房位于地下一层，面积约11 000 m2，收藏文物近20万件。2016年初，在A1库、A8库、A18库和C7库内的部分囊匣(其内部保存的文物表面未出现霉斑)和文物上发现霉斑。4月7日，针对这4个库房内的霉斑进行采样分析，采样方式为无菌棉签蘸取菌斑，然后在PDA培养皿中划线，其中样品(a)取自A8库房的纸质书画囊匣，样品(b)和(c)分别取自A1库房的木质笔筒囊匣和木质漆盒文物，样品(d)、(e)和(f)分别取自C7库房的藏式皮箱-1、藏式皮箱-2和雕花鸟纹方桌，各个样品特征见图1。

1．2．2霉菌的分离 将取回的样品置于28 ℃培养箱中培养5 d，PDA平板上出现丝状真菌。选择分离效果明显，菌落形态、颜色多样的平板，分别挑取单菌落进行划线纯化，分离2～3次。纯化得到的菌株置于4 ℃保存备用。

1．2．3DNA的提取 对纯化得到的真菌进行液体培养，菌丝尖端接种转接到PDA液体培养基中，28 ℃下120 r/min摇床培养2 d，利用真空抽滤泵获取菌丝，提取DNA采用CTAB法[5]。

1．2．4ITS序列的扩增 真核生物ITS序列(Internal Transcribed Spacer)具有广泛的序列多态性，即使是亲缘关系非常接近的两个物种在ITS序列上也会表现出差异，广泛应用于真核生物的鉴定中。扩增真核生物ITS序列使用引物ITS1(5’-TCCGT AGGTGAACCTGCGG-3’)/ITS4(5’-TCCTC CGCTTATT GATATGC-3’)[6]。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。PCR过程在50 μL的体系中(10×PCR缓冲液5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合物4 μL，10 mmol/L ITS1 2 μL，10 mmol/L ITS4 2 μL，DNA 2 μL，5 U/μL Transtaq-T DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 34.5 μL)进行扩增。PCR反应程序为预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 40 s，反应30个循环，延伸72 ℃ 10 min。

1．2．5PCR产物的纯化与测序 用1%琼脂糖凝胶电泳检PCR产物，将得到的PCR产物均采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit进行纯化回收。将纯化后的PCR产物送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，将测序结果提交到GenBank，采用NCBI Blast功能进行同源比对，采用以下标准(s：待测序列与数据库中序列的相似度)。真菌ITS基因间隔区：s≥99%为同种；95%

2 结 果

2．1 分离纯化与形态观察

通过2～3次的平板划线分离，从不同的文物表面共分离出14株真菌，利用Nikon ECLIPSE 80i型生物显微镜对其进行观察分析。从菌落形态、颜色、生长速度以及显微形态初步分为A类(菌株TJM 2、4、6、9、10和11)、B类(菌株TJM 7和8)、C类(菌株TJM 12和13)、D类(菌株TJM 1)、E类(菌株TJM 3)和F类(菌株TJM 5和14)，共6类，各类的形态特征见图2。

2．2 分子生物学鉴定结果

对测序获得的14株菌株的ITS序列与GenBank数据库中的已知的ITS序列进行同源性比对，待测菌株与数据库中参照序列的同源性大于或等于99%(菌株TJM 3和菌株TJM 6与数据库中参照序列的同源性分别是98%和94%)，分别对应毛壳菌属(Chaetomium)、曲霉属(Aspergillus)、枝孢属(Cladosporium)、畸枝霉属(Malbranchea)、派伦霉属(Peyronellaea)和Comoclathris(暂无对应的中文名称)。将获得的14株菌株的ITS序列提交到NCBI GenBank，获得登录号KY823597-KY823610。每个菌株的比对结果如表1所示。

表1 14株菌株的ITS序列同源性比对

(续表1)

注： 样品a和c未培养出真菌。

在本次采样的4个库房中，A1库和C7库的样品培养分离出了霉菌，其余两个库房没有分离出菌种。A1库的文物囊匣上分离出三株霉菌，鉴定结果是毛壳菌属、派伦霉属和Comoclathrissp．。C7库的三件文物上分离出11株霉菌，其中藏式皮箱-1上分离出五株，鉴定结果是毛壳菌属、曲霉属和枝孢属；藏式皮箱-2上分离出四株，鉴定结果是毛壳菌属、曲霉属、畸枝霉属，雕花鸟纹方桌上采样鉴定结果是毛壳菌属。本次实验结果表明，毛壳菌属菌株数量最多，在A1库和C7库均有出现；C7库内文物表面滋生霉菌状况最为严重，亟待采取有效防治措施。

3 讨 论

一些霉菌不仅对人体有直接影响，同时也是侵害不同质地文物的重要真菌[8]，其可分解各种有机物质，轻则损害文物的机械强度或展示效果，重则导致文物面貌全非[9]。因此，对霉菌种属的鉴定可以更有针对性地选择和使用抑制剂，为后续的微生物防治工作提供一定依据。本实验分离得到14株霉菌菌株，通过形态学观察及真菌ITS序列进行序列比对分析，将其鉴定为毛壳菌属、畸枝霉属、曲霉属、派伦霉属、枝孢属和Comoclathris。其中毛壳菌属数量最多，占到了6株。毛壳菌属广泛分布于自然界中各种含纤维素的基物上，是造成纸类和其他含纤维素材料生物降解的主要病害真菌之一[10-11]。球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)是毛壳菌属的一种，其适宜生长温度是18～28 ℃，高于37 ℃不能够生长；适宜生长的pH值为6～8[12]。曲霉属更是分布广泛，土壤和各种有机物上均有分布，在诸多博物馆中，也常会有曲霉属的检出[13-15]。黄曲霉(Aspergillusflavus)最适生长温度为37 ℃，且在12～48 ℃的温度范围内均可生长。黄曲霉可分泌Ⅰ型和Ⅱ型α-D-木糖苷酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶和脂酶等其他酶类，在侵染寄主的过程中降解寄主组织，提供丰富的营养成分[16]。樟绒枝霉(Malbrancheacinnamomea)是畸枝霉属的一种，其最适生长温度为45 ℃[17]，属于嗜热真菌，能同时分泌多种纤维素降解酶[18]。派伦霉属可产生纤维素酶、蛋白酶和果胶酶，可在较宽的pH范围(2.0～9.5)营养液中生长[19]，菌丝生长和产孢最适温度都为25 ℃[20]。

本次实验涉及的文物材料均为有机质，用于保存书画、木质笔筒和砚台等文物的囊匣为传统工艺制作，所用材料有纸板、纺织品和棉质填充物等。藏式皮箱为木质箱体，外表覆盖一层皮质。雕花鸟纹方桌属于木质文物。霉菌对不同质地文物材料的腐蚀破坏过程不尽相同，现以纸张、木质文物、颜料和皮质文物为例进行分析。纸张和木质文物属于植物纤维，主要由纤维素、半纤维素和木质素等组成，其中纤维素在霉菌分泌的多种生物酶作用下，会发生一系列水解反应，生成单糖葡萄糖。由于生成的葡萄糖不稳定，彻底氧化后会释放能量，部分能量储存在机体内供微生物生理活动的需要，部分以热的形式散发出去[21]。从而引起温度和湿度的变化并导致霉菌生长繁殖的加速，引发恶性循环[22]，对文物造成进一步的损害。绘画颜料分为矿物颜料和植物颜料。颜料层往往是彩绘类文物的主要部分和精华所在。矿物颜料中的胶结材料为有机胶粘剂，这些是霉菌繁殖的物质基础。霉菌形成的可溶性色素直接造成彩绘色度的改变，在生长代谢过程中形成大量的草酸盐[23]，并使颜料晶体的晶形发生变化[24]。微生物的作用可使铅丹的价态改变，在铅丹的色变中起着重要的作用[25]。皮质文物主要是由蛋白质和脂肪组成，皮质中的蛋白质被霉菌分泌出的蛋白酶(特别是一些能水解胶原纤维的酶类)水解为可以溶于水的小分子氨基酸，皮质中的脂肪类物质被霉菌分泌出的酯酶分解为小分子的甘油和脂肪酸等物质，以及皮质中还存在的少量的无机物质等，都会成为霉菌所需的营养源[26]。霉变过程不仅影响皮质文物的外观，而且会显著降低其物理力学性能[27]。

本次实验的采样时间在2016年4月初，此时北方冬季供暖已经结束，夏季供冷还未开始，空气湿度处于一年中相对干燥的时期。在对菌斑进行采样时，A1库内温度为20.5 ℃，相对湿度为53.2%；C7库内温度为20.9 ℃，相对湿度为50.3%。通过对库房内温湿度的连续监测发现，2016年上半年多数库房的温度在16～24 ℃的范围内，相对湿度在40%～80%的范围内[28]。值得注意的是，C7库中藏式皮箱和方桌是2012年由海关移交入库收藏的同批次文物，该批文物在入库前进行了消毒处理。对于此次霉菌爆发的原因，受短期内空气湿度的影响可能不大，需要对长霉文物与囊匣的使用材料、制作工艺和保存状况等进行综合分析。

霉菌的治理与预防是一项棘手的工作，由于霉菌的生长与湿度、空气运动和温度有关，当相对湿度大于70%，即便保持低温，也很有可能导致霉菌滋生；在空气流通状况差的区域，相对湿度不应超过65%，以免藏品发霉[29]。在今后需继续加强库房温湿度、污染气体和霉菌等环境因素的长期监测[30]，结合对发霉有机质文物材料成分分析与霉菌鉴定的科学实验，试图解释有机质文物中霉菌发生原因，以期对以后的霉菌防治工作提供科学依据[31]。

4 结 论

在对天津博物馆文物库房中部分文物与囊匣上出现的霉斑进行采样、培养、分离和鉴定后发现，毛壳菌属数量最多，曲霉属次之，多数为能对文物产生危害的常见菌种。这些菌种能在不同文物质地和囊匣上生长，且能适应文物库房的温湿度等环境条件，如何对其实施有效防治是迫切需要解决的问题。本实验过程中，利用分子生物学的方法将病害直接鉴定到属的水平，较形态学鉴定更快速高效。由于采样点有限，分离得到的病害真菌种类少，不能全面反应文物库房的真菌污染情况；且所分离得到的真菌绝大部分是从文物材料表面直接取样得到的，今后可与空气中真菌取样实验加以对比研究。