猪circ0001651的鉴定及其在卵泡中的表达研究

谢 苏，李梦寻，孙义姗，孙晓梅，黄 涛

（石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000）

环状 RNA（circular RNA，circRNA）是广泛存在于各种生物体中的一种特殊的内源性 RNA 分子，并具有调控基因表达的作用[1]。近年来，研究人员在人、鼠、线虫、植物、古生菌生物体内发现存在大量circRNA[2]。真核生物体中的circRNA大部分由外显子构成，具有良好的保守性以及组织特异性[3]。

circRNA具有高稳定性、组织发育阶段及细胞类型表达特异性等特征[4-5]，说明其具有成为生物标志物的潜能。与此同时，circRNA分子具有充当miRNA分子海绵、调控基因转录、与 RNA 结合蛋白相互作用及翻译蛋白质等生物学功能[6]。目前关于circRNA在动物繁殖中的调控作用研究不多。Hansen等[7]研究发现，SrycircRNA可以间接参与小鼠的性别调控。同时，circRNA在哺乳动物大脑发育和组织发育的过程中可能发挥重要作用[8-9]；circRNA在胎儿大脑组织中的表达[10]也可能发挥重要作用。本实验从RNA-seq结果中选择梅山与杜洛克猪M2卵泡表达差异极显著的circ0001651作为目标circRNA，旨在探究circRNA在猪卵泡发育过程中的表达情况，并通过生物信息学分析预测其可能的调控机制。 circRNA在猪卵泡发育上面尚未见报道，本文首次在高产猪和低产猪卵巢中对circRNA进行分析研究，为进一步探索circRNA调控母猪繁殖机理的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验样品采集 实验选取二胎、发情正常、繁殖表现符合品种特征的梅山和杜洛克成年母猪各3头，相同条件下饲喂，每天对其发情进行观测。发情出现静立反应时记做发情周期第0天，发情周期第14天注射兽用氯前列烯醇注射液，注射后第4天屠宰，取不同级别卵泡样，按直径分类（M1卵泡直径：3.1～5.0 mm；M2卵泡直径：5.1～7.0 mm）于液氮中冻存，同时取垂体、下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪、卵巢、子宫、子宫角、输卵管组织，用锡纸包裹，于液氮速冻后于-80℃保存备用。

1.2 主要试剂与仪器 主要试剂包括TRIzol试剂（Invitro-gen，Carlsbad，CA，USA）；反转录试剂盒Primer-ScriptTMRT regagent Kit（TaKaRa）；LightCycler 480 SYBR Green、八连管（Roche）；RNA线性酶；DNA Maker、西班牙进口Agarose琼脂糖等。

主要仪器有超低温冰箱（-80℃）、恒温水浴锅、高压灭菌锅、移液枪、PCR仪、超净工作台、NanoDrop 2000、LightCycler 480实时荧光定量PCR仪、分析天平、高速离心机、电热恒温培养箱、水平电泳槽电泳仪；GelDoc X R型凝胶成像系统等。

1.3 总RNA提取与cDNA合成 取梅山和杜洛克成年母猪的两级卵泡和不同组织100 mg于液氮中研磨，TRIzol法分别提取样本总RNA，用2%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000验证总RNA的完整性、浓度及纯度，-80℃保存备用；实时荧光定量PCR所用cDNA的合成分别按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行操作。

1.4 RNase R消化 对一部分总RNA进行RNase R消化处理，最后用RNA clean up商品试剂盒对 RNA 进行回收，具体步骤可参考试剂盒说明书，-80℃保存备用。

1.5 引物设计与合成 在差异表达的circRNAs中挑选了circ0001651，设计特异性扩增反向剪切位点的引物（图1）。引物设计好后交由新疆乌鲁木齐市昆泰锐公司合成，引物序列见表1。

图1 circRNA模式图

表1 circ0001651及内参引物序列

1.6 circ0001651组织表达谱分析 实验以各组织与卵泡cDNA为模板，GAPDH为内参，对circ0001651进行实时荧光定量PCR检测以分析其在不同组织中的表达情况。反应体系：SYBR®Green I PCR Mix 10 μL；上、下游引物（0.01nmol/μL）各 1μL；cDNA 模板 2 μL；加dd H2O至20 μL。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s。

1.7 circ0001651功能预测 本实验使用targetscan7.0和miRanda软件对circ0001651靶基因结合位点进行分析预测。并通过DAVID软件和KOBAS软件分别对circ0001651的宿主基因进行GO分析和KEGG分析。1.8 统计分析 以 2-△△Ct法[11]计算 circ0001651 在各组织及梅山猪和杜洛克猪各级卵泡中的相对表达量，用SPSS 19.0软件中One-Way ANOVA方法分析，比较其在两猪种内不同级别卵泡及品种间同级别卵泡表达水平的差异。

2 结果与分析

2.1 circRNA鉴定 将RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示，成功扩增出circ0001651的反向剪切位点（图2）。同时进行了DNA测序验证，测序结果进一步验证了扩增结果的准确性（图3）。

图2 circRNA琼脂糖凝胶电泳

图3 circ0001651首尾链接序列测序峰图

2.2 circRNA对RNase R的消化抗性 对circ0001651进行RNase R酶消化抗性实验，通过荧光定量PCR方式进行检验。如图4所示，circRNA由于具有特殊的闭合环状的物理结构，对RNase R消化具有一定的抗性，RNase R酶消化后仍然可检测到circRNA。而线性的GAPDH内参基因经RNase R酶消化会发生降解，RNase R酶消化后无法检测到其表达。

图4 circRNA实时荧光定量分析

2.3 circ0001651在不同组织中的表达分析 如图5所示，circ0001651在下丘脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、子宫、子宫角、输卵管、脂肪、卵巢中均有不同程度的表达，说明circ0001651在猪的各个组织中广泛表达。

图5 circ0001651组织表达谱

2.4 circ0001651在卵泡中的表达分析 由图6可知，circ0001651在梅山猪M2卵泡中的表达量显著高于M1卵泡（P＜0.05），在杜洛克猪M1卵泡中的表达量极显著高于M2卵泡（P＜0.01），提示该circRNA可能与卵泡发育有关。杜洛克猪M1卵泡中的表达量极显著高于梅山猪M1卵泡（P＜0.01），梅山猪M2卵泡中的表达量极显著高于杜洛克M2卵泡（P＜0.01），提示circ0001651在高低产猪种卵泡中的表达具有显著差异性，可能具有促进卵泡发育的作用。

2.5 靶基因预测结果 通过targetscan7.0和miRanda软件对circ0001651靶基因结合位点进行了分析预测。结果见表2。

图6 circ0001651在梅山猪与杜洛克猪不同级别卵泡中的表达

表2 circ0001651靶基因预测

2.6 circ0001651的GO与KEGG分析 通过对circ0001651的靶基因进行GO和KEGG通路富集分析，预测其功能，结果如图7所示。GO分析表明，circ0001651的宿主基因在细胞生长发育过程中发挥着重要作用，包括Notch信号通路的负调控（GO:0045746）、凋亡过程（GO:0006915）、细胞形态发生调控（GO:0022604）、细胞周期调控（GO:0051726）、细胞生长调节（GO:0001558）、经典Wnt信号通路的负调控（GO:0090090）。

KEGG通路分析显示，该circRNA的宿主基因参与调控细胞生长发育相关信号通路，包括Hippo信号通路（ssc04390）、FoxO信号通路（ssc04068）、MAPK信号通路（ssc04010）、细胞周期信号通路（ssc04110）、p53信号通路（ssc04115）、JAK STAT信号通路（ssc04630）和PI3K-Akt信号通路（ssc04151）。

图7 GO分析

2.7 circRNA-miRNA-mRNA调控网络构建 利用软件Cytoscape3.6.0，根据RNA-seq结果构建circRNA-miRNA-mRNA调控网络，发现具有较多靶基因结合位点的sscmiR-1343以及ssc-miR-328可能协同circ0001651参与母猪的妊娠调控过程，见图8。

图8 circRNA-miRNA-mRNA调控网络图

3 讨 论

circRNA成为目前RNA领域研究的最新热点，目前circRNA的研究多数停留在芯片检测和高通量测序层面上，对其机理的探究仅局限于人类的疾病、免疫及模式生物上，而在猪等重要的经济动物生长发育及繁殖上circRNA的研究相对滞后，仍然处于摸索阶段。

Ye等[12]在水稻和拟南芥中分别鉴定出约12 000个和6 000个circRNA。Guo等[13]通过RNA测序检测出7 112种人类circRNA及635种小鼠circRNA。Fan等[14]研究表明，circRNA可能在哺乳动物的早期胚胎发育中扮演重要角色。Gao等[15]发现细胞共有的circRNA通常具有较高的表达水平，说明这些circRNA可能具有重要的生理功能。

有研究表明，circRNA大部分都是由外显子序列构成的，在不同物种中具有保守性及组织时空表达特异性[16]。Memczak等[17]、Kino等[18]研究结果显示，超过100 种circRNA的表达量显著高于对应的mRNA，说明其可能适合作为临床血液样本中的生物标志物。与此同时，circRNA可以通过调控与癌症相关miRNAs或信号通路以控制肿瘤的发生发展[19]。本实验所选的circRNA是通过高通量测序技术结合计算机软件分析获得，高通量测序结果显示circ0001651在梅山和杜洛克猪中等卵泡中差异极显著。本研究利用Real-time PCR法检测circ0001651在2组标本间的相对表达量发现，Real-time PCR法和高通量测序法测得的基因表达的差异具有相同趋势，间接证实了高通量测序的可靠性。

本研究发现，circ0001651在杜洛克猪各组织中广泛表达且范围波动较大，其中在卵巢中的较高表达提示circ0001651可能参与母猪生殖活动过程；circ0001651在梅山猪M2卵泡中的表达量极显著高于杜洛克猪M2卵泡，与高通量测序结果表达趋势一致。此外，本研究通过构建circRNA-mRNA调控网络预测得到其潜在靶基因FRMD1、DUSP5、IL20RB可能通过Hippo信号通路、MAPK信号通路（ssc04010）以及JAK STAT信号通路之间的关联作用影响细胞的增殖、分化及凋亡等；靶基因GADD45G与细胞周期及卵巢发育相关通路如FoxO信号通路以及p53信号通路等关联，可能参与了卵泡发育及排卵过程；LAMB3参与了PI3KAkt信号通路，而PI3K-Akt通路对于调控哺乳动物卵巢发育及卵泡发生发展过程有着重要意义[20-21]。因此，circ0001651调控卵泡发育可能是通过其靶基因间接实现的，其与预测所得靶基因之间具体的靶向关系仍需进一步证明。

4 结 论

组织表达谱结果显示，circ0001651在猪下丘脑、垂体、输卵管、卵巢中表达水平相对较高。circ0001651在梅山猪M2卵泡中的表达量极显著高于杜洛克猪M2卵泡。通过KEGG通路分析发现，circ0001651参与细胞周期、凋亡及卵巢生长发育相关通路。circRNA功能预测结果表明，circ0001651可能通过对其靶基因的调控作用间接参与卵泡发育过程。