暴露高活性晶面的TiO2纳米管的制备及生物活性

权 月，尹 杰，王园园，包斯元，鲁 雄,2，冯 波,2，周 杰,2

(1 西南交通大学 材料科学与工程学院，成都 610031； 2 西南交通大学 材料先进技术教育部重点实验室，成都 610031)

钛及钛合金因具有良好的生物相容性，被广泛应用在人工骨关节、形状记忆合金等医用领域[1-2]。钛本身为生物惰性，且大部分反应都发生在钛表面的TiO2层，其生物学性能主要由其表面结构所决定，为增强其生物活性，常对其进行表面改性以适应不同的生物应用环境。

锐钛矿型TiO2相较于金红石型有较高的生物活性和稳定性，因此受到较多关注[3-5]。而锐钛矿型TiO2不同晶面具有不同的原子密度，从而使得具有不同优势晶面族的TiO2具有不同的表面能和化学活性。其中，锐钛矿TiO2晶面中表面能依次为(101)(0.44J/m2)<(100)(0.53J/m2)<(001)(0.90J/m2)[6-8]，表面能越大的晶面具有相对更好的潜在化学活性。一般来说，TiO2中晶面的分布遵从Wulff规则[9-11]，锐钛矿中主要以表面能较小热力学稳定的(101)面为主，而较高能量的活性表面(001)晶面较少。由于(001)晶面具有更高的潜在化学活性，近年来，制备具有更高比例(001)晶面的锐钛矿TiO2引起了广大研究者浓厚的兴趣，并取得了一定的进展[12-14]。Yang等[15]以四氟化钛为前驱体，氢氟酸为生长控制剂，180℃水热反应不同时间后，得到规整的四方锥截面状TiO2，其(001)晶面比例达47%。随后，此课题组[6]研究了合成暴露(001)晶面的TiO2，然而制备方法都是采用HF作为生长控制剂以稳固(001)晶面族。探索低氟或无氟的合成方法成了目前TiO2晶面定向合成的一个研究热点。同时，对于TiO2晶面的性能研究目前还主要集中在其光电应用方面[16-17]，而关于TiO2中晶面比例对生物学性能的研究较少。

本工作在前期阳极氧化制备TiO2纳米管工作的基础上[18-19]，采用多次阳极氧化技术，通过调节电解液中H2O含量制备具有不同晶面族比例的高度有序的TiO2纳米管阵列。通过扫描电子显微镜(SEM)、X射线衍射(XRD)对试样进行表面形貌表征，采用生物矿化和蛋白吸附来考察不同晶面对TiO2纳米管生物活性的影响。

1 实验

1.1 试样制备

纯钛片(TA2，φ10mm×1.5mm)打磨和预处理后，在HF∶HNO3∶H2O=1∶4∶5(体积比)的混酸中进行化学抛光，清洗、干燥备用。40V恒压下反应120min，然后在去离子水中超声震荡，将TiO2纳米管层剥离。样品清洗烘干后进行第二次阳极氧化，恒定电压40V。电解液配比及阳极氧化时间如表1所示。阳极氧化结束后进行热处理，450℃保温120min。

表1 阳极氧化工艺参数Table 1 Technological parameters of anodic oxidation

1.2 生物矿化

每种样品设置3个平行样，浸入2倍浓度模拟体液(2×SBF)，放置于37℃恒温水浴震荡箱中(60r/h)恒温震荡，每24h换一次液，分别在3天和7天取出试样，室温干燥。利用SEM和XRD对试样进行检测，并用称重法计算各个试样矿化前后平均增重。

1.3 蛋白吸附

磷酸盐缓冲溶液(PBS)为溶剂，配制牛血清白蛋白(BSA,1mg/mL)溶液。各试样分别浸入45mL BSA溶液中，37℃水浴恒温震荡，分别吸附0.5，1，2，4，6，12，24h后取出2mL BSA溶液。通过紫外分光光度计(UV，UV-2550)在280nm波长处测量试样BSA溶液的吸光度，计算试样表面蛋白质的吸附量；采用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)测量试样表面吸附的BSA结构中的酰胺特征键。

1.4 样品表征

采用扫描电镜(FEI，Quanta200)观察试样阳极氧化后的表面形貌；利用(PANalytical X Pert Pro)X射线衍射仪检测晶体学特征，加速电压40kV，电流40mA，Cu靶，扫描范围20°～80°，扫描模式为连续扫描；用衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪(ATR-FTIR，Nicolet SXFYIRI 70/Magna 550)研究蛋白吸附后样品表面的成分；利用能量色散光谱(EDS，FEI，Quanta200)分析试样生物矿化后表面元素情况。

2 结果与讨论

图1是电解液中含H2O为1%，2%，3%和4%的一次阳极氧化后各试样表面的SEM图。可以看出，经过一次阳极氧化后TiO2纳米管呈簇状分布，簇与簇之间存在较大缝隙，且有相互倾轧的趋向，管口有大量的破损。这可能是由于在有机电解液体系中纳米管表面的不均匀腐蚀形成的。电解液中H2O含量的不同会造成纳米管生长速率的不一致，为了得到形貌高度有序且管长近似一致的纳米管阵列，将各试样进行不同时间的二次阳极氧化，表面形貌及断面如图2所示。各样品表面纳米管阵列呈网状分布，且管状趋近坚固的蜂窝结构，管径大小均匀，约90～110nm，表面光滑，管口无破损及长短不一的情况。由图2右上的断图面可以看出，经过不同时间的二次阳极氧化后，样品的管长都在4μm左右。说明经过两次阳极氧化后，各样品表面TiO2纳米管阵列形貌规整，管径及管长基本保持一致。

图1 一次阳极氧化后试样的SEM图 (a)1%H2O；(b)2%H2O；(c)3%H2O；(d)4%H2OFig.1 SEM images of the samples after the first anodic oxidation (a)1%H2O;(b)2%H2O;(c)3%H2O;(d)4%H2O

图2 不同时间二次阳极氧化后试样的SEM图(a)45min；(b)60min；(c)75min；(d)90minFig.2 SEM images of the samples after the second anodic oxidation with different time(a)45min；(b)60min；(c)75min；(d)90min

图3为经过二次阳极氧化和热处理后各样品的XRD谱图。热处理后纳米管转换成锐钛矿型，但是由于所形成的纳米管层比较薄，有部分X射线穿透照射到钛基底，所以XRD谱图上出现了钛峰。一般而言，锐钛矿TiO2最强衍射峰为(101)晶面，位于2θ=25.28°。然而在2%H2O条件下制备的TiO2纳米管样品，其位于37.8°的(004)晶面的衍射峰强度却明显强于(101)晶面峰强，(004)晶面为优势晶面。说明通过改变电解液中H2O含量，可以让TiO2沿着[001]晶向择优生长，即表现出一定的纹理。虽然这种纳米管的生长行为在以往的文献中也有报道[16,20-21]，但很少有深入研究其结构和性能的。

图3 二次阳极氧化和热处理后试样的XRD谱图(a)1%H2O;(b)2%H2O;(c)3%H2O;(d)4%H2OFig.3 XRD patterns of the samples after the secondary anodic oxidation and heat treatment(a)1%H2O;(b)2%H2O;(c)3%H2O;(d)4%H2O

当一种材料晶体学取向发生变化时，可以用织构系数Tc(hkl)半定量地衡量指定晶面取向变化的程度，其范围为1(无纹理)到N(单取向晶体)。锐钛矿TiO2(004)晶面的织构系数Tc(004)可以根据Ariosa等报道的方法[22]，用式(1)进行计算。

(1)

表2 (004)晶面的织构系数和强度比值Table 2 Texture coefficient and intensity ratio of (004) facet

图4为生物矿化3天和7天后试样表面的SEM图。可以观测到所有样品表面都被一层沉积物所覆盖，说明试样表面的纳米管结构能够使钙磷盐沉积。

图4 矿化3天(1)和7天(2)后试样表面SEM图(a)1%H2O；(b)2%H2O；(c)3%H2O；(d)4%H2OFig.4 SEM images of the samples surface mineralized 3 days(1) and 7 days(2)(a)1%H2O;(b)2%H2O;(c)3%H2O;(d)4%H2O

电解液中H2O含量为2%制备得到的TiO2纳米管(B试样)生物矿化3天和7天后EDS能谱结果见图5。Ca，P和O峰很强，说明样品表面CaP盐的沉积物厚度较大，已经掩盖了基底TiO2的信号。矿化3天和7天后B试样表面通过EDS能谱估算得到的Ca/P比分别为1.58和1.68，接近于羟基磷灰石(HA)中1.67的Ca/P比，推测各样品表面的沉积物主要是以HA为主的CaP盐。

图5 B试样(2%H2O)生物矿化3天(a)和7天后(b)EDS能谱图Fig.5 EDS spectra of B sample(2%H2O) mineralized 3 days(a) and 7 days(b)

图6为不同H2O含量下阳极氧化样品生物矿化3天和7天后的XRD谱图。可以看出，每组样品中都检测到锐钛矿TiO2和HA的衍射峰，说明生物矿化后纳米管表面的沉积物主要为HA。

图6 矿化3天和7天后试样表面的XRD谱图(a)1%H2O；(b)2%H2O；(c)3%H2O；(d)4%H2OFig.6 XRD patterns of the samples surface mineralized for 3 days and 7 days(a)1%H2O;(b)2%H2O;(c)3%H2O;(d)4%H2O

图7 生物矿化后试样增重及增重速率Fig.7 Mass gain and mass gain rate of the samples mineralization

图8是在波长为280nm条件下利用朗伯比尔定律测得的各试样24h牛血清白蛋白(BSA)吸收曲线，Blank为空白对照组。蛋白吸附是一个动态平衡的过程，即在吸附的同时存在蛋白质的脱附。在初始的2h内，各试样蛋白吸附量几乎与时间呈线性增加，并在2h左右达到吸附初期的最大值。随着时间的增加，脱吸附速率逐渐增加，并在4h左右超过吸附速率，造成试样表面吸附的蛋白量有所下降，最后吸附和脱吸附过程在6h左右达到初步平衡，经过24h的恒温放置，蛋白的吸附与脱落达到最终平衡。蛋白吸附量由多到少依次为：B>A>C>D>Ti，具有(001)晶面最高比例的B组的蛋白吸附量最多。

图8 试样在BSA中24h的吸附曲线Fig.8 Adsorption curves of samples after soakingin BSA solution for 24h

图9 蛋白吸附后的试样表面FT-IR谱图Fig.9 FT-IR spectra of the sample surfaces after protein adsorption

综合各样蛋白吸附曲线和红外光谱结果可以发现，(001)晶面优势取向更为明显的TiO2纳米管样品能够促进更多的蛋白质吸附。因此可以认为，暴露更多高活性的(001)晶面能够对蛋白质的吸附起到积极的促进作用，其相应的样品则具有更好的生物活性。

3 机理讨论

相关文献报道已经证实，F-作为保护剂可以优先吸附在TiO2(001)晶面族上，降低的表面能可以稳定(001)晶面族并促进其择优生长[27]。在本实验中，TiO2(001)晶面族除了受到F-的作用，还受到电解液中H2O含量的影响。一方面，H2O作为一种必需成分在阳极被电解并提供氧与金属钛结合，以形成无定形TiO2纳米管，H2O含量的增加可以提高TiO2形成速率。另一方面，电解液中H2O电离出的OH-与TiO2结合，二者的大量接触会使无定形的纳米管在退火过程中被破坏，从而阻碍(001)晶面族的形成。综上所述，F-对(001)晶面的择优生长起促进作用，而水分子具有双重作用，即H2O作为氧源可以促进氧化的进程，但随着H2O含量的增加，使得OH-和TiO2大量接触又抑制TiO2形成特定(001)晶面。在本实验条件下，2%H2O样品中锐钛矿TiO2具有相对较高的(001)晶面比例。

(001)优势晶面的锐钛矿具有较高的反应活性，主要有两个原因：(1) (001)晶面的Ti—O—Ti键角(约120.5°)比(101)晶面的Ti—O—Ti键角大得多(图10)；(2) (001)晶面比(101)晶面的原子密度大(图11)，可以提供更多的不饱和Ti原子，进而与OH-形成Ti—OH基团，而Ti—OH基团则是TiO2生物活性的关键物种，一般来说样品表面Ti—OH基团密度越大，其生物活性越好。因此(001)优势晶面能够促进HA的矿化沉积，并提高表面蛋白质的吸附量。

图10 锐钛矿TiO2球棍模型示意图(a)(001)晶面；(b)(101)晶面Fig.10 Schematic diagrams of ball stick model for anatase TiO2(a)(001) facet;(b)(101) facet

图11 锐钛矿TiO2的晶体结构Fig.11 Crystal structure of anatase TiO2

4 结论

(1)利用二次阳极氧化法，在金属钛表面制备得到高度有序的TiO2纳米管阵列，通过控制电解液中H2O含量可以对TiO2中高活性的(001)晶面族占比进行可控调节。

(2)2%H2O得到的TiO2纳米管中(001)晶面族择优取向最明显，锐钛矿TiO2(004)晶面的织构系数Tc(004)可达4.76。

(3)生物矿化和蛋白吸附实验结果表明，得益于(001)晶面族更高的化学活性，具有更高比例(001)晶面族的样品具有更高矿化沉积速率，并有利于生物矿化进程，还可以增加材料表面蛋白吸附量，体现出更为优异的生物学活性。