深圳地区孕妇甲硫氨酸合成酶还原酶和亚甲基四氢叶酸还原酶的基因多态性分布

薛丽霞，赖晓燕，郑定容

1 深圳市宝安区西乡预防保健所 (广东深圳 518102)；2 宝安区中心医院社区健康服务管理中心(广东深圳 518102)

研究表明，叶酸缺乏会扰乱正常细胞的DNA合成、修复和甲基化，使孕妇具有致癌的易感性[1]。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是两种重要的叶酸代谢酶，具有重要的生理功能，其基因多态性会影响体内同型半胱氨酸及叶酸的代谢水平。近年来，大量的临床流行病学研究资料表明，MTHFR、MTRR与妊娠高血压、复发性流产、神经管畸形和心脑血管疾病的发生有密切关系[2-3]，严重影响母婴的心身健康。本研究针对深圳市地区孕妇，开展MTHFR和MTRR基因多态性的分子流行病学分析，旨在阐明本地区人群的MTHFR和MTRR基因多态性遗传特征，为深圳市地区孕妇个体化的孕期保健提供科学依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取深圳市宝安区中心医院2017年1月至2018年7月进行孕期检查的孕妇2 466名作为研究对象，年龄18～45岁，平均(26.7±6.6)岁。纳入标准：(1)相互间无血缘关系；(2)孕妇知情并同意本研究；(3)深圳市户籍；(4)同意进行口腔黏膜细胞采样。排除标准：(1)患有精神类疾病无法配合；(2)患有风湿免疫系统疾病；(3)严重肝肾功能不全；(4)合并有恶性肿瘤或其他恶性疾病。本研究均获得深圳市宝安区西乡预防保健所医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1试剂及仪器

Taq DNA聚合酶由德泰生物科技(南京)有限公司提供，dNTP由北京百奥莱博科技有限公司提供，牛血清白蛋白(BSA)由合肥博美生物科技有限责任公司提供，10×聚合酶链式反应(PCR)缓冲液由上海远慕生物科技公司提供，DNA片段长度标准物PBR322DNA/HacⅢ Makers由华美生物工程(广州)公司提供，Hinf I限制性内切酶及其缓冲液由北京百奥莱博科技有限公司提供，其余试剂为分析纯。实时荧光聚合酶链式反应(RT-PCR)仪器采用美国伯乐生命医学产品有限公司 Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR仪，步骤均严格按照说明书进行操作及判定结果。

1.2.2引物的设计及合成

参照Tsuyoshi等[4]方法设计正反及探针义链，内参基因为β-actin均由FAM标记，由广州中山大学达安基因有限公司合成，MTRR A66G、MTHFR A1298C和MTHFR C677T引物序列见表1。

表1 引物与探针序列

1.2.3PCR检测

(1)PCR反应体系：2×缓冲液10.0 μl，10.0 μmol/L的引物P1 1.0 μl，10.0 μmol/L引物P2 1.0 μl，模板DNA 1.0 μl，双蒸H2O 7.0 μl。PCR反应条件及循环：93 ℃变性2 min，95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环，75 ℃延伸5 min，基因分析采用Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR仪自带的基因分析应用软件，严格按照说明书进行操作及判定结果，再进行各组中MTRR A66G、MTHFR A1298C和MTHFR C677T的基因表达水平的比较。(2)质量控制：每批次均设置阴性质控和阳性质控，试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供，步骤严格按试剂盒使用说明操作，检测服务由中山大学达安基因股份有限公司提供。

1.2.4标本采集

采集受检者首先用温开水漱口，接着用医用消毒棉签在颊黏膜两侧轻刮多次，然后置于1.5 ml 0.9%氯化钠注射液的离心管中，最后多次搅动棉签让口腔黏膜上皮细胞尽可能多地落入0.9%氯化钠注射液中，之后用柱式抽提试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司提供)抽提DNA标本；吸取5 μl DNA标本，加水稀释至1.0 ml，充分震荡混匀，并应用SWB-800型微量紫外可见分光光度计(由深圳市速王科技有限公司提供)260 nm和280 nm处读取吸光度(OD)值，测定DNA浓度/纯度，满足浓度2～20 ng/μl，纯度A260/A280=1.7～2.0，储存于DW-40L188立式医用低温冰箱(由青岛海尔集团有限公司提供)-20 ℃备用。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，多组间比较采用行×列表资料的χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

深圳地区孕妇MTHFR C677T位点基因型纯合突变TT型频率为15.8%(390/2 466)，高于广东省惠州[5]的10.9%，低于河南省郑州[6]的40.7%和河北省三河市[7]的37.4%，差异有统计学意义(P<0.05)；MTHFR A1298C位点基因型纯合突变CC型频率为5.8%(143/2 466)，高于河南省郑州[6]的1.3%和河北省三河市[7]的2.3%，低于广东省惠州[5]的7.2%，差异有统计学意义(P<0.05)；MTRR A66G位点基因型纯合突变GG型频率为3.8%(94/2 466)，低于广东省惠州[5]的5.6%、河北省三河市[7]的7.5%和河南省郑州[6]的5.4%，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

广东是我国出生缺陷高发省份之一，出生缺陷是导致围生儿死亡的重要因素，也是影响人口素质的重要因素，出生缺陷的发生受环境、营养和遗传因素的共同影响。

MTRR和MTHFR是叶酸代谢的关键酶，MTHFR介导5，10-亚甲基四氢叶酸(MTHF)转变成5-MTHF，在MTRR及其辅酶维生素B12的催化下提供一个甲基给同型半胱氨酸(Hcy)，使之转化成为甲硫氨酸，而自身转换为四氢叶酸。甲硫氨酸则在ATP供能的情况下转化为S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM是体内生化反应的甲基储备物质，可以为细胞内的蛋白质和DNA甲基化反应提供原料；THF是一种还原型叶酸，是辅酶形式的叶酸的母体化合物，对正常血细胞的生成具有促进作用；当叶酸缺乏或叶酸相关的还原酶活性降低，使THF缺乏或者叶酸不能转变为THF，无传递碳单位，使多种生物合成受阻，造成巨幼红细胞性贫血。在怀孕期，叶酸代谢通路发生障碍导致Hcy不能顺利转化为甲硫氨酸，使血浆中Hcy浓度增高。Hcy是甲硫氨酸代谢产生的中间产物，Hcy可通过诱导氧化应激促进炎症反应进程，容易引起孕妇血管内皮细胞损伤和功能异常，引起胎盘血栓性病变，导致胎儿发生神经管畸形。

MTHFR A1298C、C677T和MTRR A66G位点的多态性会降低酶活性，影响叶酸代谢和利用，与唇腭裂、唐氏综合征、先天性心脏病、神经管畸形等出生缺陷，以及妊娠高血压、复发性流产等孕期疾病密切相关。

本研究首次分析了MTHFR A1298C、C677T和MTRR A66G基因多态性在广东深圳地区孕妇中的分布情况，与已报道的其他地区的数据进行比较，显示深圳地区孕妇MTHFR A1298C、C677T和MTRR A66G 位点多态性与其他地区汉族女性的频率存在差异，该种差异可能与人群对多种疾病的群体易感性有关，具有不同的遗传分布特征。

MTHFR C677T和MTRR A66G等位基因频率呈现南方低北方高的趋势，与我国出生缺陷发病率南方低北方高的趋势基本一致；MTHFR A1298C突变等位基因频率基本上呈现北方低南方高的趋势。MTHFR C677T的C被T取代后氨基酸发生错译，位于催化区域的丙氨酸被缬氨酸代替会导致MTHFR的热稳定性和酶活性下降22%，MTHFR C677T的CT型和MTHFR A1298C的AC型存在协同作用，它们会导致对应的MTHFR酶活性下降到正常的36%，严重影响叶酸在体内的有效利用；MTRR A66G的A被G取代后氨基酸发生错译，位于催化区域的苏氨酸被丙氨酸取代导致MTRR的热稳定性和酶活性下降，从而引起叶酸和甲硫氨酸代谢障碍，最终造成叶酸吸收的下降及Hcy在人体内蓄积，MTRR A66G基因多态性导致神经管畸形风险增加2.6倍；如果在怀孕期间给孕妇补充叶酸，能够将先天性心脏病、神经管缺陷和唇腭裂发生率降低至少60%。

综上所述，深圳地区孕妇的MTHFR和MTRR基因多态性分布特征存在差异，通过对深圳地区孕妇进行遗传筛查，针对存在叶酸代谢障碍的遗传风险人群，给予叶酸补充干预，更合理地指导孕妇增补叶酸，是有效达到出生缺陷及孕期疾病一级预防目的的重要方法。

表2 不同地区MTRR A66G和 MTHFR A1298C、C677T基因型分布比较[名(%)]