高效氯氰菊酯对中华绒螯60 d慢性毒理及病理研究

张悦，吴晟旻，张晓君，陈辉，方苹，王晶晶

(1. 扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225000；2. 南京环境科学研究所环境保护部 江苏 南京 210000；3. 江苏省渔业技术推广中心，江苏 南京 210000)

高效氯氰菊酯，化学名为2，2-二甲基-3-(2，2-二氯乙烯基)环丙烷羧酸-α-氰基- (3-苯氧基)苄酯，戊酸氰醚酯，属于拟除虫菊酯农药杀虫剂[1]，用来杀灭农作物害虫，预防鱼类寄生虫疾病[2]。由于其具有广谱性、低毒性和高效性，因此在全国的养殖区域大规模使用[3]。拟除虫菊酯不仅会对引起水生动物中毒病死，还会对生态环境造成污染[4]。

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)属节肢动物门，软甲纲，十足目，爬行亚目，方蟹科，绒螯蟹属，是一种经济蟹类，又称河蟹，毛蟹，清水蟹，大闸蟹，是我国淡水养殖的重要品种之一[5]。随着河蟹养殖地域范围越来越大，养殖产量逐年上升，养殖模式不断变化，河蟹病害问题日趋严重[6]。近年来，多地区暴发河蟹肝胰腺病变综合征(俗称“水瘪子”病)，对河蟹养殖业造成了严重的损失[7]。2015—2016年，在江苏兴化地区大面积暴发河蟹肝胰腺病变综合征，3—4月开始大量出现病症，5—8月上旬达到该病高发期，塘口发病率为30%～40%，严重的高达90%～100%。高温期过后，病死率逐渐下降直至达到平稳甚至恢复的状态[8]。经调查发现兴化地区养殖池塘普遍存在泼洒化学农药氯氰菊酯杀毒的现象[9]，推测氯氰菊酯可能会造成中华绒螯蟹的肝胰腺病变。该实验探究在相同环境条件下不同浓度的高效氯氰菊酯对中华绒螯蟹扣蟹体质量和存活率的影响，并通过石蜡切片，设置3个梯度浓度探究氯氰菊酯对河蟹组织影响。

1 材料与方法

1.1 扣蟹

试验于2017年6月在南京环境科学研究所国家环境保护农药环境评价与污染控制重点实验室进行，试验用中华绒螯蟹扣蟹由江苏省渔业技术推广中心提供。扣蟹在试验前暂养1周以上。保持每天光照14 h，温度22.9～23.2 ℃，pH值7.71～7.82，溶解氧大于饱和度的80%，每天投食2次，至试验开始前24 h为止。饵料主要成分：粗蛋白 > 30.0%、粗脂肪 > 2.0%、粗纤维 <3.0%、灰分 < 12.0%、水分 < 10.0%。

在驯养环境中适应48 h后，7 d驯养期内受试扣蟹病死率为0，因此该批扣蟹(批号：F20170615K)符合试验用扣蟹要求。试验开始时，扣蟹的平均体质量为5.949 g，相对标准偏差2.14%。

1.2 试验用水

试验用水为曝气处理24 h以上的自来水，水质硬度为145 mg/L(以CaCO3计)，pH值7.20。

1.3 试验试剂和仪器设备

水质参数测定仪；分析天平；20 L玻璃缸；水浴槽；手动单道移液器；氯氰菊酯原药；蜡块；苏木精-伊红染料；无水乙醇。

1.4 受试浓度的选择

根据扣蟹急性毒性试验结果，受试物对扣蟹96 h-LC50=0.612 mg/L。因此，60 d延长毒性试验设置配制浓度为0.01、0.10、1.00 mg/L3个受试物处理组，同时设置不含受试物的空白对照组和溶剂对照。

1.5 受试物溶液的制备

试验时，准确称取1.0531 g高效氯氰菊酯(纯度95%)，用乙腈溶解并定容至100 mL，得到10 000 mg/L的受试储备液。将受试物贮备液置于4 ℃冰箱贮存，试验期间每隔3 d重新配制储备液。

试验时，准确吸取适量受试物贮备液加入试验用水中，机械搅拌30 min后配制成一定浓度的受试物溶液。受试物溶液每隔24 h更新。试验期间，测试容器始终加盖。具体配制方法见表1。

表1 受试物溶液的配置方法

1.6 暴露条件

在该试验条件下，受试物比较稳定，因此试验采用半静态法(换水频率为24 h)。试验期间，各项试验条件控制如下。

暴露时间：60 d；暴露溶液体积：2 L；承载量：5.0～7.0 g/L(拭干体表水分后的湿重)；暴露密度：20只/缸；光照：每天14 h光照；温度：23.0～23.1 ℃；溶解氧浓度：饱和度的85%～97%，试验期间不曝气；饲喂：每天喂食，饲喂量为扣蟹体初始体质量的2%；清洁：每次更新溶液的同时清理玻璃缸。

1.7 观察

每天观察和记录受试扣蟹的死亡情况，当观测到扣蟹没有呼吸运动或触碰无反应，即判定扣蟹已病死。每天观察和记录其他非致死效应，包括与对照组扣蟹明显不同的体外特征和行为。

1.8 测定

试验开始前逐条测量体质量。试验结束后逐条测量存活扣蟹体质量。试验过程中不进行任何受试扣蟹体质量的测量。在0、7、14、28、54、60 d测定受试溶液的溶解氧含量、pH值和温度。

1.9 病理组织切片的制备

在 96 h-LC50 的0.10 μg/L，0.19 μg/L，0.59 μg/L浓度胁迫第 15天，再分别从3个浓度组随机取出3 只河蟹，迅速取出肝胰腺用Bouin氏液固定24 h，固定样品经 70%、80%、95%、100%梯度酒精脱水， 二甲苯透明，常规石蜡包埋。使用手摇式切片机切片( 厚度约 5μμm)， HE( 苏木精-伊红)染色，Olympus显微镜观察、拍片。

1.10 数据处理

采用Bartlett’s tests(ANOVA，STATA 10.0)多元对比分析受试组扣蟹的假定比增长率，确定最低显著效应浓度(LOEC)(P<0.05)与无显著效应浓度(NOEC)。

2 结果与分析

2.1 试验条件

试验期间，试验条件测定结果见表到2、表3和图1。结果表明：试验期间，空白对照组和受试组溶液pH值在7.65～7.83范围内，溶解氧保持在饱和溶解氧的85%～97%之间，温度控制在23.0～23.1 ℃，保证试验只有氯氰菊酯浓度不同这一个变量，其他条件相同。

2.2 试验有效性

2.2.1 对照组试验 与受试物处理组相同的试验条件下，同时开展试验用水空白和溶剂对照试验。试验结束时，空白对照组和溶剂对照组受试扣蟹活动正常、无病死。

2.2.2 受试扣蟹承载量 单位水体载鱼量为5.0～7.0 g(拭干体表水分后的湿重)/L。

2.2.3 试验有效性 试验期间，空白对照组和受试组溶液pH值在7.65～7.83范围内，溶解氧保持在饱和溶解氧的85%～97%之间，温度控制在23.0～23.1 ℃。空白对照组和溶剂对照组受试扣蟹活动正常。试验期间，受试物浓度保持恒定，因此各项试验条件满足试验有效性标准(溶解氧：不低于空气饱和浓度的60%；空白对照组受试扣蟹病死率不超过10%)。

2.3 病死率与危害影响

表3为在不同浓度作用下，扣蟹病死率及异常情况，表4为扣蟹60 d体质量前后变化表。图1为在不同浓度作用下，扣蟹存活率情况折线图。

表2 扣蟹病死率及异常情况

表3 扣蟹60 d体质量前后变化表

图1 不同浓度的氯氰菊酯对中华绒螯蟹扣蟹60 d存活情况

试验结果表明，中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)扣蟹在高效氯氰菊酯(0.10、1.00 mg/L处理组)作用下摄食量逐渐减少，剩饵增多，由表4可以看出在高效氯氰菊酯作用下中华绒螯蟹体质量明显降低。尤其是 1.00 mg/L浓度组最明显。0.01 mg/L处理组和对照组扣蟹无明显异常现象。

2.4 氯氰菊酯对中华绒螯蟹各组织结构的影响

组织切片观察发现，3个氯氰菊酯浓度下，中华绒螯蟹各组织结构均发生了一定的变化。尤其是中华绒螯蟹肝胰腺组织最明显，正常状态下河蟹的肝小管结构完整，上皮细胞排列整齐，无空泡现象的发生。0.10 μg/L低浓度下，轻微出现空泡，肝小管基膜增厚。0.19 μg/L浓度下，肝小管间的血细胞数量增多，空泡数量增多，基膜破裂，部分肝小管发生水肿、变性，细胞结构模糊。在0.59 μg/L浓度下，出现大面积的空泡化结构，细胞排列出现紊乱，发生坏死解体，细胞核固缩、破碎，使官腔内出现许多细胞碎片[10-13]。

图2 0.10 μg/L氯氰菊酯浓度下河蟹肝胰腺组织病理切片

图3 0.19 μg/L氯氰菊酯浓度下河蟹肝胰腺组织病理切片

图4 0.59 μg/L氯氰菊酯浓度下河蟹肝胰腺组织病理切片

图5 氯氰菊酯作用下河蟹鳃组织病理切片

高效氯氰菊酯除了引起中华绒螯蟹的肝胰腺损伤，还会对肌肉、鳃组织有一定破坏。如图5、图6，正常的中华绒螯蟹鳃呈现干净无污物，上皮细胞排列整齐。而如图5受到高效氯氰菊酯作用的中华绒螯蟹的鳃叶间出现大量杂质，上皮细胞发生崩解。

中华绒螯蟹的附肢肌肉为横纹肌，健康蟹的附肢肌细胞核呈圆形或梭形，位于细胞的边缘，肌纤维排列整齐，横纹清晰，纤维间的肌质网密集。在氯氰菊酯作用下，部分肌肉横纹肌发生模糊，肌纤维发生萎缩，肌纤维间和肌束间水肿而间隙增大，尤其肌束膜与肌束间的分离更为明显。

图6 氯氰菊酯作用下河蟹肌肉组织病理切片

3 结论

在有效半静态法[14](换水频率24 h)试验条件下，60 d试验期间，受试物对中华绒螯蟹扣蟹60天最低可观察效应浓度(LOEC)和无可观测效应浓度(NOEC)，具体如下：60d-NOEC(体质量)=0.01 mg/L；60d-LOEC(体质量)> 0.01 mg/L。

试验结果表明，采用Bartlett’s tests(ANOVA，STATA 10.0)将每个浓度组的体质量与对照组比较的结果显示，受试物处理组(0.01 mg/L)体质量与空白对照组相比差异不具统计学意义(P>0.05)， 受试物处理组(0.10， 1.00 mg/L)体质量与空白对照组相比差异具统计学意义(P<0.05)。

中华绒螯蟹是典型的甲壳动物，在一生中要经历多次蜕壳。在60 d试验期间，观察到受试扣蟹至少蜕壳一次。在蜕壳过程中，蟹体大量吸收水分，体质量增加明显，而在蜕壳后的生长中，体质量增长缓慢，水分逐渐为组织生长所代替，生长不连续而呈跳跃式的特点。刚蜕壳的受试扣蟹对高效氯氰菊酯十分敏感，特别是0.10、1.00 mg/L处理组刚蜕壳螃蟹病死率明显增加，在1.00 mg/L浓度组最明显，而0.01 mg/L处理组和对照组扣蟹无明显异常现象。

一定浓度的氯氰菊酯会对河蟹的肝胰腺、鳃和肌肉组织产生明显的病理变化。且在不同的浓度下，呈现不同的病变状态，浓度越高对中华绒螯蟹组织破坏力越强。