复方中草药KFJ制剂对感染弧菌病的凡纳滨对虾免疫活性的影响

朱志东，朱宇嘉，吕莉，董碧莲，蔡延渠，辛年香，朱盛山

(1. 广东药科大学新药研发中心广东 广州 510006；2. 广州普精生物科技有限公司，广东 广州 510006)

联合国粮农组织指出：弧菌病一直困扰着科学家、动物卫生主管部门和养殖者，很难采取有效的预防和治疗措施。据2015年对凡纳宾对虾病害的调查结果，在成虾样本中，弧菌病占74.6%，每年因弧菌病造成的经济损失高达10亿美元[1]。目前，控制水产动物弧菌病的主要是用抗生素，不仅效果不明显，而且导致诸多问题，如药残、耐药、破坏生态平衡、对动物有毒副作用等[2-3]。中草药为绿色药物，具有多功效、全面提高免疫力、不易诱发病原菌耐药性等优势，对推进水产无公害养殖病害的防治具有重大意义[4]。研究显示，中草药能显著提高水产动物免疫力、抗氧化能力及疾病抵抗力等[5-7]。鉴于此，国内外学者从免疫学角度对虾病进行防治研究，提高对虾自身非特异免疫力，以达到增强抗病力的目的[8-9]。该试验采用复方中草药KFJ制剂饲喂凡纳滨对虾，抑杀对虾体内弧菌，通过刺激免疫系统，来提高其防御能力，进而达到治病、防病的目的。试验通过测定虾肝胰腺中总抗氧化能力(T-AOC)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性3种非特异免疫酶相关的变化，探讨复方中草药KFJ制剂提高虾非特异免疫力的效果，为KFJ制剂产品的推广应用提供基础数据。

1 试验材料

1.1 凡纳滨对虾

225万尾(体长8～10 cm)，广东省中山市海腾养虾场提供，养于室内搭棚水泥池(150个，体积58 m3/个，放养虾苗15 000尾)中，循环水，连续充氧，投喂饲料。

1.2 药品和仪器

由广东某研究所提供的复方中草药KFJ制剂(2 g/mL)。冰箱(海尔，BCD-257SL)；紫外分光光谱仪(MV-1700，岛津)；超低温冰箱；5418R低温高速离心机；Mulitskan MK3 酶标仪；总抗氧化能力、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶试剂盒。

2 方法

2.1 分组与取样

2.1.1正常组 从放苗开始，以KFJ制剂与饲料1∶6拌料投喂，连续投喂2 d，1 d 1次，4 d为一个间隔，定期预防，未见发病，为该试验正常虾。随机取正常虾2 000只，放入没有投苗同样大小的水泥池中，循环水，连续充氧；从停喂KFJ制剂第3天开始，分别在第72、75、78、84、96、120和168 h，取吃到料的虾用滤纸轻轻吸干表面水分，解剖出虾肝胰腺组织，每组6只虾混样，冰浴匀浆，4 ℃下2 500 r/min离心10 min，-20 ℃保存。

2.1.2 感染发病组 已养45 d对虾，有6个养殖池，开始发病(依据症状、弧菌培养，诊断感染弧菌病)。病虾发病初期活动能力减弱，趴塘，食欲减退，慢料；发病中期出现游塘，浮便，肠道分节；发病后期有偷死、白便、长便、拖便，肝脏开始萎缩，无血色，肝胰脏包膜不完整，甚至消失。

2.1.3 感染发病对照组 随机取发病初期感染弧菌病虾2 000只，放入没有投苗同样大小的水泥池中，循环水，连续充氧，以正常饲料投喂，分别在第1、3、6、12、24、48和96 h，取吃到料的虾用滤纸轻轻吸干表面水分，解剖出虾肝胰腺组织，每组6只虾混样，冰浴匀浆，4 ℃下2 500 r/min离心10 min，-20 ℃保存。

2.1.4 感染发病给药组 随机取发病初期感染弧菌病虾2 000只，放入没有投苗同样大小的水泥池中，循环水，连续充氧，以复方中草药KFJ制剂与饲料1∶3拌料投喂，连续投喂2 d，1 d 2次，于投料完毕后分别在第1、3、6、12、24、48和96 h，取吃到料的虾用滤纸轻轻吸干表面水分，解剖出虾肝胰腺组织，每组6只虾混样，冰浴匀浆，4 ℃下2 500 r/min离心10 min，-20 ℃保存。

2.2 样品解冻

取冰冻保存的各待测肝胰腺样品，置于0 ℃水解冻，用以各项肝胰腺指标的测定。

2.3 总抗氧化能力的测定

取各待测肝胰腺上清液样品0.05 mL和双蒸水0.05 mL，分别加入K2S2O3缓冲液1 mL，ABTS工作液2 mL和过氧化氢溶液0.5 mL，混合均匀，37 ℃水浴30 min后，分别加入过氧化氢酶溶液0.1 mL，混合均匀，放置10 min，于520 nm处测定各样品的吸光度，按下式计算各组织样品的总抗氧化能力。

总抗氧化能力=(测定OD值-对照OD值)/0.01/30×(反应液总液体量/样本取样量)×样本测试前稀释倍数(单位/毫升组织液)

2.4 酸性磷酸酶的测定

取双蒸水、0.1 mg/mL酚标准应用液和各待测肝胰腺上清液样品0.05 mL，分别加入缓冲液和基质液0.5 mL，充分混匀，37 ℃水浴30 min后，分别加入碱液1 mL和显示剂1.5 mL，立即混匀，室温静置10 min，于520 nm处测各待测样品的吸光度值，按下式计算酸性磷酸酶活性。

2.5 碱性磷酸酶的测定

取双蒸水、0.1 mg/mL酚标准应用液和各待测肝胰腺上清液样品0.05 mL，加入0.5 mL 0.1mol/L的硼酸盐缓冲液、4-氨基安替吡啉基质液，充分混匀，37 ℃水浴30 min，加入铁氰化钾显色剂1.5 mL，立即混匀，室温静置10 min，于520 nm处测各样品的吸光度值，按下式计算碱性磷酸酶活性。

2.6 统计分析

采用 Excel和SPSS 13.0 软件对数据进行统计分析。先对数据作单因素方差分析(ANOVA)，处理若有差异统计学意义，再作 Duncan’s 法多重比较，P<0.05表示差异具统计学意义。

3 结果

3.1 症状观察

正常组，虾活力正常，摄食良好，体色通透，肝脏分明，肠道饱满，未见有偷死；感染发病对照组，病虾活动能力逐步减弱，虾身瘦弱，体色发暗，拖便、食欲减退，慢料、减料，肌肉白浊，断肠、空肠有5成，肝胰腺萎缩、糜烂、白膜消失，偷死约1 kg/d；感染发病给药组，虾的活力明显增强，料台拖便，空肠空胃、断肠的虾基本没有，肝脏白膜变清晰、肝脏有血色，料台上的虾明显增多，体色变通透，偷死只有2尾/d，吃料恢复正常。

3.2 复方中草药KFJ制剂对虾肝胰腺总抗氧化能力(T-AOC)的影响

图1 T-AOC在96 h内的变化(n=6)

由图1可知，在96 h的观察过程中，复方中草药KFJ制剂对虾肝胰腺T-AOC活性有影响，投喂96 h内感染发病给药组T-AOC活性均高于感染发病对照组和正常组；感染发病给药组T-AOC水平在12 h达到最大值，而48 h后降低，趋于平缓、逐渐恢复正常水平；感染发病对照组T-AOC活性在3 h时为最大值，而后降低，3 h之后开始低于正常值，而正常组无明显变化。由感染发病给药组和感染发病对照组对比可见，感染发病给药组与感染发病对照组肝胰腺T-AOC在96 h内的试验对比差异具统计学意义(P<0.01)，从第6 h开始，2组出现统计学意义差异，第12 h出现最大差异，差距达9.7 U/mL。结果表明，复方中草药KFJ制剂能抑杀肝胰腺弧菌，显著提高虾肝胰腺T-AOC中活性。

3.3 复方中草药KFJ制剂对虾肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)活性的影响

由图2可知，复方中草药KFJ制剂对虾肝胰腺ACP活性有影响，在3 h之后感染发病给药组和感染发病对照组肝胰腺的ACP活性出现统计学意义差异(P<0.05)。而感染发病给药组ACP活性3～24 h呈上升，后趋于平缓；而感染发病对照组ACP活性在3 h达到最大值，3～12 h缓慢下降，12 h之后快速降低，且显著低于正常水平，而正常组保持稳定。结果表明，复方中草药KFJ制剂能提高虾肝胰腺ACP活性。

图2 ACP在96 h内的变化(n=6)

3.4 复方中草药KFJ制剂对凡纳滨对虾肝胰腺碱性磷酸酶(AKP)活性的影响

两组肝胰腺中AKP活性在96 h内的变化见图3所示，感染发病给药组先1～6 h呈升高，6 h后缓慢下降，后恢复正常水平；感染发病对照组AKP水平在6 h达到最大值，而后下降，而正常组维持不变。在3、6、12、24 h感染发病给药组AKP活性与感染发病对照组之间出现极具统计学意义的差异(P<0.01)，其中6 h感染发病给药组与感染发病对照组差值最大，为13.03 U/mL。结果表明，复方中草药KFJ制剂能提高虾肝胰腺AKP的活性。

图3 AKP在96 h内的变化(n=6)

4 讨 论

T-AOC、ACP、AKP的活性在虾体免疫和抗病过程中发挥着很重要的作用，其活性的高低常被用作衡量对虾免疫活力高低的参照指标[10]。

虾感染弧菌发病初期，症状为活动减弱，摄食减少，慢料，粪便长条，体色偏暗，试验取病虾做弧菌培养，确诊弧菌病。根据试验数据推论，当感染发病对照组出现病症，酶的活性在前期都有小幅的上升，但随着病情的恶化，尤其是白膜完全消失时，检测弧菌严重超标，肝胰腺坏死、萎缩、无血色，此时酶活性都急剧下降。可能虾急性肝胰腺坏死是弧菌超标导致，而当弧菌感染虾肝胰腺，肝胰腺白膜逐步消失，酶活性快速下降，虾体质、免疫系统遭受破坏，虾进入快速发病期。感染发病给药组，在出现肝胰腺界线不分明，不通透等症状，及时给药发现，酶活性慢慢恢复，虾的活力明显增强，肝脏白膜开始变的清晰、肝脏用药结束三天后有血色，因此，酶活性与急性肝胰腺坏死有着紧密连续，后续养殖过程中应该更加注重强化虾肝胰腺，提高虾肝胰腺酶活性，从而减少病害的爆发，预防工作显得尤为重要，KFJ制剂对保护虾肝胰腺坏死方面有着独特的效果，应该加大临床应用研究。

发病对照组在弧菌侵入凡纳滨对虾后，肝胰腺T-AOC、ACP、AKP活性下降；而发病给药组的酶活性逐渐上升，后恢复正常水平， 表明复方中草药KFJ制剂不仅抑杀虾体内弧菌，而且在保护虾肝脏方面起到了重要作用。检测T-AOC、ACP、AKP活性，发现感染发病对照组在弧菌侵入凡纳滨对虾肝胰腺后，造成肝胰腺T-AOC、ACP、AKP活性下降；而感染发病给药组的酶活性逐渐上升，后恢复正常组水平，反应复方中草药KFJ制剂在对虾清除肝胰腺弧菌方面起到了重要作用。研究结果显示，正常组酶活性存在小范围的波动可能与吃药量有关。

发病对照组初期酶活性缓慢下降，到48 h后快速下降，可能与取样时虾的病情严重程度有关，因此，取样必须保证取吃料的虾，取样尽可能一致，减少不必要误差。但发病对照组病情总体是越来越严重，肝胰腺急性坏死，难于保持取样一致。

弧菌病是影响对虾养殖业最为常见、危害较严重的一类疾病，随着养殖业集约化程度的提高，养殖过程中的疾病也日趋严重，而弧菌病具有很强的传染性，在对虾越冬、人工育苗及成虾养殖过程中，均有可能患上弧菌病，感染率可达100%，发病严重的虾池病死率可高达90%以上[11]。

近年来弧菌病引起越来越多学者的广泛关注，目前，对于弧菌病的防治主要采用抗生素，长期大量使用抗生素会带来一系列严重后果：水环境污染，导致养殖环境恶化，生态平衡失调，妨碍水产动物正常生长；耐药性微生物大量出现等，易引起疾病的爆发和流行，且难于防控，使水产业蒙受巨大的经济损失[11]；弧菌病尚无有效防控措施。该试验所用的复方中草药KFJ制剂，对弧菌病的防治效果显著，有望成为“替代抗生素”比抗生素更好的新型中成药，并对人类自身的健康以及畜牧业食品的安全具有重大的社会效益和经济价值。