不同产地海带脂肪酸组成的比较分析

徐 华 张 茹 张进杰 楼乔明 杨文鸽 徐大伦

(宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

海带(Luminariajaponica)又名昆布、江白菜、海带菜，为褐藻门(Phaeophyta)褐子纲(Phaeosporae)海带目(Laminariales)的一种大型海藻[1-2]。海带在我国有着悠久的食用历史，其含有丰富的褐藻酸、甘露醇、膳食纤维，以及维生素和矿物质等活性成分，是一种天然的低脂肪低热量的保健食品，符合现代人的饮食结构[3]。近年来，随着药理和临床研究的不断深入，海带在调节血糖、降血脂、预防心脑血管疾病，以及防癌抗癌和提高免疫力等功效方面日益受到重视[4-6]。

目前，海带是我国养殖规模和产量最大的海洋经济藻类，为我国水产养殖的支柱产业之一，其养殖范围北起辽宁，南至福建、广东沿岸；2015年我国海带产量已达141万t，居世界首位[7-8]。国内外对海带的研究和开发主要集中于多糖[9-11]、多酚[12]和蛋白质等活性成分[13]，对海带脂肪酸组成和多不饱和脂肪酸提取亦有报道[14-15]，但对不同产地海带脂肪酸组成的比较分析尚未见报道。海带总脂含量低、脂质组成复杂，且富含多不饱和脂肪酸，因此，如何有效提取海带总脂，并对脂肪酸进行色谱分析是准确分析海带总脂脂肪酸组成的关键所在。本研究采用溶剂法对福州、宁波和青岛3个产地海带的总脂进行提取优化，并采用酸甲酯化衍生和气相色谱-质谱技术对3个产地海带总脂的脂肪酸组成进行比较分析，以期为海带的脂肪酸分析、营养评价，以及海带的精深加工和产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干制海带分别购自福州、宁波和青岛当地市场；37种脂肪酸甲酯混标和鱼油脂肪酸甲酯混标，购自美国Sigma公司；二氯甲烷、甲醇、正己烷、异丙醇、甲基叔丁基醚等分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

6980N气相色谱仪、5973质谱仪，美国Agilent公司；SER148/6型脂肪测定仪，意大利VELP公司；Laborota 4000 efficient型旋转蒸发器，德国Heidolph公司。

1.2 试验方法

1.2.1 海带预处理 干制海带表面经清理，去除杂质和残叶，经粉碎制成海带粉，放于4℃冰箱中备用。

1.2.2 海带总脂的提取 二氯甲烷-甲醇法[16-17]：称取10 g海带粉，加入200 mL二氯甲烷-甲醇混合液(2∶1，v∶v)，超声振荡30 min，并浸提3 h；抽滤后，滤液用50 mL 0.9%氯化钠溶液洗涤分层，收集二氯甲烷层，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到海带总脂。

正己烷-异丙醇法[18-19]：称取10 g海带粉，加入200 mL正己烷-异丙醇混合液(3∶2，v∶v)，超声振荡30 min，并浸提3 h。抽滤后，滤液用80 mL 5%硫酸钠溶液洗涤分层，收集正己烷层，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到海带总脂。

甲基叔丁基醚法[20]：称取10 g海带粉，依次加入60 mL甲醇和200 mL甲基叔丁基醚，超声振荡30 min，并浸提3 h；抽滤后，滤液用50 mL蒸馏水洗涤分层，收集甲基叔丁基醚层，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到海带总脂。

索氏提取法：称取10 g海带粉，放入滤纸筒中，用100 mL石油醚(沸程30～60℃)于75℃加热抽提3 h；抽提结束后，石油醚提取液经减压浓缩得到海带总脂。

1.2.3 甲酯化衍生 参照楼乔明等[21]的方法。称取10 mg海带总脂，加入1 mL 10%浓硫酸-甲醇溶液，于60℃水浴中甲酯化15 min，冷却后加入1 mL正己烷振荡，静置分层后，取上清液供GC-MS分析。

1.2.4 脂肪酸检测 色谱条件：HP-INNOWax石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，载气为高纯氦气，采用恒压模式，压力54 kPa，分流比25∶1；进样口温度230℃，检测器温度250℃，柱温以3℃·min-1的升温速率由140℃升至210℃，并于210℃保持7 min，整个分析过程为30 min。

质谱条件：GC-MS接口温度280℃，EI离子源, 电离能量70 eV，离子源温度230℃，扫描周期2.84次·s-1，质量扫描范围m/z 50～500 u。

1.3 数据分析

每次试验平行测定3次，利用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析法(ANOVE，Tukey检验)进行显著性检验，并通过Duncan′s法进行单因素多重比较分析，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同方法对海带总脂提取效果的影响

由表1可知，二氯甲烷-甲醇法提取的海带总脂含量较高，其中青岛产地的总脂含量最高，占海带干重的0.86%，福州(0.75%)和宁波(0.69%)次之；索氏提取法和甲基叔丁基醚法提取的海带总脂含量低于二氯甲烷-甲醇法，且正己烷-异丙醇法提取的海带总脂含量显著低于二氯甲烷-甲醇法(P<0.05)。

表1 不同方法提取的海带总脂含量

注：不同小写字母表示同一产地不同方法间差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase mean significant difference among different methods in the same origin at 0.05 level.

2.2 不同产地海带脂肪酸的比较分析

3个产地海带总脂经二氯甲烷-甲醇法提取，采用酸甲酯化衍生和气相色谱-质谱分析，取得了理想的色谱分离效果，其总离子流色谱图见图1。通过标准品对照、质谱特征分析、数据库检索和等碳链长值等多种方法进行综合鉴定分析[22-24]，从海带总脂中共鉴定出30种脂肪酸(表2)。

海带脂肪酸由C14-C20脂肪酸组成，且以C14：0、C16：0、C18：1n-9、C18：2n-6、C18：4n-3、C20：4n-6(AA)和C20：5n-3(EPA)为主。在所鉴定出的12种饱和脂肪酸(saturated fatty acids，SFA)中，以直链饱和脂肪酸为主，其中C16：0含量最高，占到脂肪酸总量的23.44%～24.32%；其次为C14：0，福州产地海带中C14：0含量为7.92%，远高于宁波(7.02%)和青岛(6.48%)且差异显著(P<0.05)；海带中C18：0和C20：0含量较低，分别仅占脂肪酸总量的0.54%～1.05%和0.37%～0.47%。同时，从海带总脂脂肪酸中鉴定出6种单支链饱和脂肪酸，包括3种异式脂肪酸和3种反异式脂肪酸，占脂肪酸总量的1.29%～1.84%。

海带总脂中单不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)7种，以C18：1n-9、C16：1n-7和C16：1n-9为主；C18：1n-9为海带总脂中含量最高的单不饱和脂肪酸，其中青岛产地海带中C18：1n-9含量为19.11%，显著高于福州(17.34%)和宁波(18.11%)。单不饱和脂肪酸中C16：1n-7和C16：1n-9含量次之，宁波产地海带中C16：1n-7含量为4.09%，高于福州(3.75%)和青岛(3.32%)且差异显著(P<0.05)；青岛产地海带中C16：1n-9含量为2.96%，远高于宁波(2.68%)和福州(0.71%)且差异显著(P<0.05)。

海带总脂中多不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)11种，以C18：2n-6、C18：4n-3、C20：4n-6(AA)和C20：5n-3(EPA)为主。对比3个产地海带的多不饱和脂肪酸发现：福州产地海带中的C20：4n-6(AA)和C18：2n-6含量分别为10.12%和8.76%，高于宁波(9.41%、6.57%)和青岛(8.77%、5.40%)且差异显著(P<0.05)；C20：5n-3(EPA)(6.18%)显著低于宁波(8.13%)和青岛(9.40%)。

在脂肪酸定性定量分析的基础上，对3个产地海带的主要脂肪酸类型进行比较分析(表3)。3个产地海带中的饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量较为接近，分别为34.17%～36.16%和37.42%～39.82%，且均显著高于单不饱和脂肪酸含量(24.02%～27.83%)。福州产地海带中的n-3 PUFA含量为14.86%，显著低于宁波(17.72%)和青岛(18.75%)；n-6 PUFA含量为23.98%，显著高于宁波(19.43%)和青岛(18.20%)，使得福州产地海带的n-3/n-6比值显著低于宁波(0.91)和青岛(1.03)。C20：4n-6和C20：5n-3为海带重要的多不饱和脂肪酸，福州产地海带中两者脂肪酸总含量(EPA+AA)为16.30%，显著低于宁波(17.54%)和青岛(18.17%)；福州产地海带中两者多不饱和脂肪酸比值(EPA/AA)仅为0.61，亦显著低于宁波(0.86)和青岛(1.07)。

序号Number保留时间Retention time/min脂肪酸Fatty acid产地 Origin福州 Fuzhou宁波 Ningbo青岛 Qingdao13.32iso-C14:00.27±0.02b0.20±0.03a0.35±0.03c23.59anteiso-C14:00.10±0.03a0.13±0.02a0.20±0.02b33.80C14:07.92±0.21c7.02±0.25b6.48±0.16a44.09C14:1n-50.22±0.03b0.14±0.03a0.32±0.02c54.47iso-C15:00.16±0.02a0.22±0.03b0.18±0.03ab64.74anteiso-C15:00.26±0.02b0.19±0.02a0.27±0.03b74.99C15:01.06±0.04c0.57±0.03a0.64±0.02b86.16anteiso-C16:00.48±0.02b0.38±0.03a0.41±0.02a96.53C16:024.04±0.43a24.32±0.57a23.44±0.51a106.81C16:1n-90.71±0.05a2.68±0.09b2.96±0.08c116.88C16:1n-73.75±0.14b4.09±0.17c3.32±0.11a127.35C16:2n-40.98±0.03b0.27±0.02a1.16±0.03c138.26C17:00.29±0.03a0.55±0.03c0.35±0.02b148.63C17:1n-70.74±0.05a0.98±0.04b0.81±0.04a159.31iso-C18:00.36±0.02b0.17±0.02a0.43±0.02c1610.26C18:00.75±0.06b0.54±0.03a1.05±0.04c1710.61C18:1n-917.34±0.37a18.11±0.42a19.11±0.37b1810.74C18:1n-70.22±0.01a0.62±0.03c0.48±0.02b1911.52C18:2n-68.76±0.19c6.57±0.16b5.40±0.13a2012.12C18:3n-63.61±0.05c3.02±0.11a3.35±0.06b2112.87C18:3n-32.88±0.07a3.13±0.08b2.76±0.05a2213.50C18:4n-35.13±0.14a5.77±0.19c5.43±0.09b2314.67C20:00.47±0.03b0.46±0.03b0.37±0.02a2414.85C20:1n-91.04±0.05b1.21±0.05c0.72±0.04a2515.34C20:2n-60.97±0.04c0.19±0.02a0.26±0.03b2616.04C20:3n-60.52±0.03c0.24±0.02a0.42±0.02b2716.58C20:3n-30.26±0.02a0.25±0.02a0.59±0.02b2817.05C20:4n-6(AA)10.12±0.28c9.41±0.35b8.77±0.25a2918.03C20:4n-30.41±0.02a0.44±0.02a0.57±0.02b3018.51C20:5n-3(EPA)6.18±0.14a8.13±0.22b9.40±0.27c

注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；AA：二十碳四烯酸；EPA：二十碳五烯酸。下同。

Note: Different lowercase in the same line mean significant difference at 0.05 level. AA: Arachidonic acid. EPA: Eicosapentaenoic acid. The same as following.

3 讨论

海带营养成分以褐藻胶、甘露醇、粗纤维、蛋白质及无机盐等矿物质元素为主，总脂含量较低[25-26]，且海带总脂含有甘油酯、磷脂和糖脂等多种脂质成分，组成复杂[27]。总脂提取主要依靠有机溶剂的极性和溶解性，正己烷-异丙醇法、甲基叔丁基醚法和索氏提取法所涉及的提取溶剂依次为正己烷、甲基叔丁基醚和石油醚，这些有机溶剂的极性和溶解性均较弱，上述3种提取方法适用于总脂含量高且以甘油酯为主的样品，因此，对总脂含量低且脂质组成复杂的海带样品不能进行完全有效提取，致使海带总脂提取量较低。同时，索氏提取法提取温度高，易破坏海带总脂中的不饱和脂肪酸，降低不饱和脂肪酸含量，故正己烷-异丙醇法、甲基叔丁基醚法和索氏提取法不适用于海带总脂的提取。本研究结果表明，二氯甲烷-甲醇法能对海带总脂进行有效提取，提取量高于正己烷-异丙醇法、甲基叔丁基醚法和索氏提取法，且其操作简单，试剂毒性较低，是海带总脂提取的理想方法。

表3 不同产地海带脂肪酸的类型比较Table 3 Classification comparison of fatty acids of Laminaria japonica from different origins

甲酯化衍生是气相色谱-质谱法分析脂肪酸组成的重要预处理过程。目前，常用的甲酯化衍生方法有酸甲酯化法和碱甲酯化法，碱甲酯化法只适用于结合型脂肪酸，酸甲酯化法既适用于结合型脂肪酸，亦适用于游离型脂肪酸[14]。海带脂质组成复杂，脂肪酸常以甘油三酯、糖脂、磷脂和游离脂肪酸等多种形式存在，故酸甲酯化法更适合于海带脂肪酸的甲酯化衍生。同时，通过对脂肪酸甲酯结构特征分析和已有文献[14, 28]比较，极性毛细管柱更适合于海带脂肪酸组成分析。本研究采用极性毛细管柱(HP-INNOWax)优化程序升温条件，取得了理想的色谱分离效果。

海带中的单不饱和脂肪酸以C18：1n-9为主，占总脂肪酸含量的17.34%～19.11%。C18：1n-9能有效降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量，亦能有效减少机体内的氧化应激产物，降低机体的过度性炎症反应，有助于机体康复[29]。海带多不饱和脂肪酸以C18-PUFA和C20-PUFA为主，其中C20：4n-6、C20：5n-3为海带等褐藻的标志性多不饱和脂肪酸。本研究中，海带总脂脂肪酸组成中未检测出C22：6n-3(DHA)，这与前人报道结果一致[30-31]。此外，福州、宁波、青岛3个产地海带中的C20：4n-6(AA)和C20：5n-3(EPA)存在显著差异，致使n-3 PUFA、n-6 PUFA、n-3/n-6、EPA+AA和EPA/AA等指标也存在显著差异，这可能与海带生长所处海域的水温、光照和纬度等有一定相关性[32-33]。C20：4n-6(AA)为重要的n-6型多不饱和脂肪酸，是前列腺素E2、前列环素、血栓烷素A2和白细胞三烯等二十碳酸衍生物的直接前体，能有效调节氧化应激，激活调节血小板和白细胞功能活性，在预防、治疗炎症等方面发挥重要作用[34-35]。C20：5n-3(EPA)属于n-3多不饱和脂肪酸，其能促进神经系统发育、改善大脑功能、提高记忆力，并能有效调节血脂和血糖，预防血栓、动脉硬化等心脑血管疾病[36-37]。本试验结果表明，海带中C20：4n-6和C20：5n-3的总量高达16.30%～18.17%，说明海带可作为有效的膳食来源补充人体所需的C20：4n-6、C20：5n-3等多不饱和脂肪酸。

4 结论

二氯甲烷-甲醇法的总脂提取效率高于正己烷-异丙醇法、甲基叔丁基醚法和索氏提取法，是海带总脂提取的有效方法。同时，酸甲酯化(10%浓硫酸-甲醇溶液)和极性毛细管柱(HP-INNOWax)更适合于海带脂肪酸的甲酯化衍生和气相色谱分析。福州、宁波和青岛3个产地海带经二氯甲烷-甲醇法提取，其总脂含量依次为0.75%、0.69%和0.86%，且3个产地间无显著差异。通过酸甲酯化衍生和气相色谱-质谱分析从海带总脂中共鉴定出30种脂肪酸，以C16：0、C18：1n-9、C20：4n-6(AA)和C20：5n-3(EPA)为主，且3个产地海带在脂肪酸上存在显著差异。福州产地海带中C20：4n-6(AA)显著高于宁波和青岛，而C20：5n-3(EPA)显著低于宁波和青岛，致使3个产地海带中的n-3 PUFA、n-6 PUFA、n-3/n-6、EPA+AA和EPA/AA等指标存在显著差异。本研究结果为海带脂肪酸分析、营养评价，以及海带的精深加工和产品开发提供了一定的理论依据。