双醋瑞因减轻小鼠角膜碱烧伤炎症反应的实验研究△

代闫芳 刘素素 岳娟 简守珺 张芬芬 魏静静 司玮 张红敏

作者单位：450003 河南省郑州市，郑州大学人民医院、河南省立眼科医院、河南省眼科研究所、河南省眼科学与视觉科学重点实验室

双醋瑞因是白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)抑制剂，具有确切的抗炎作用[1]，目前主要用于骨关节炎的治疗[2]，近年来其在其他疾病中的治疗作用也逐渐受到关注，但是在眼科方面还未见应用报道。双醋瑞因是一种小分子化合物，具有较好的角膜穿透性及较高的角膜浓度[3]，该药可能具有减轻角膜炎症的作用。角膜碱烧伤是临床常见的眼外伤，其所造成的无菌性炎症，除了化学物质的直接作用外，炎症反应贯穿整个角膜碱烧伤病理过程[4]，是一种很好的角膜炎症模型。因此，本文主要探讨双醋瑞因滴眼液对小鼠角膜碱烧伤的抗炎作用及其初步的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级C57BL/6J雄性小鼠174只，鼠龄8～12周，体质量23～28 g，购自南京大学南京生物医药研究院，小鼠的饲养与使用均遵照视觉与眼科研究协会制定的科研动物使用规范，经河南省眼科学与视觉科学重点实验室管理及伦理审查委员会批准。

1.2主要试剂及仪器

1.2.1实验试剂NaOH(1310-73-2，美国Sigma公司)；地塞米松磷酸钠注射液(H19983005，新乡华青药业公司)；双醋瑞因滴眼液(河南省眼科学与视觉科学重点实验室制备，科研专用)；FITC/Gr-1(11-5931-85，eBioscience)；PE/F480 (12-4801-82，eBioscience)；荧光素钠(H11619-1009，美国Alcon公司)；髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)测定试剂盒(A044，南京建成生物工程研究所)。

1.2.2主要仪器手术显微镜(YZ20T4，苏州六六视觉科技股份有限公司)；裂隙灯显微镜(SLM-8E，中国康华瑞明)；角膜剪及显微镊(苏州明仁医疗器械厂)；全自动数字切片扫描仪(Pannoramic 250/MIDI，匈牙利3 D HISTECH)；离心机(D1008E，美国Scilogex公司)；分光光度计(UV-1601，日本Shimadzu公司)。

1.3方法

1.3.1角膜碱烧伤模型的建立经裂隙灯显微镜检查角膜无异常的小鼠174只，参考文献[5]制作角膜碱烧伤模型，具体如下：按照80 mg·kg-1的剂量腹腔内注射10 g·L-1戊巴比妥钠进行全身麻醉，用 4 g·L-1盐酸奥布卡因滴眼液进行角膜表面麻醉，以直径2 mm的圆形滤纸片浸入0.3 mol·L-1NaOH溶液中60 s，在干燥滤纸上吸除多余的碱液，立即均匀地贴于小鼠角膜中央60 s，取下滤纸后用20 mL生理盐水迅速冲洗1 min，制作小鼠角膜碱烧伤模型。

1.3.2分组及给药方式造模后使用裂隙灯显微镜观察小鼠角膜，1.5 d后依据角膜临床评分采用随机数字分组法将小鼠角膜碱烧伤模型分为双醋瑞因组、地塞米松组和生理盐水组，每组各58只。随后分别给药干预，双醋瑞因组每2 h给予双醋瑞因滴眼液滴眼1次，共6次，间隔12 h后重复进行，直至实验结束；地塞米松组每4 h给予地塞米松滴眼液滴眼1次，共3次，间隔12 h后重复进行，直至实验结束；生理盐水组给予生理盐水滴眼，给药方法同双醋瑞因组。为保证用药效果，每次给药后保持眼裂睁开约30 s，确保药物进入结膜囊。

1.3.3模型观察各组随机选取16只小鼠于造模成功后2 d(用药后0.5 d)、3 d(用药后1.5 d)、4 d(用药后2.5 d)、5 d(用药后3.5 d)在裂隙灯显微镜下观察角膜，进行角膜混浊度以及病灶面积的临床评分，并使用裂隙灯显微镜对小鼠眼部进行拍照，临床具体评分规则参照文献。角膜混浊度[6]：1分为角膜轻度雾状混浊，瞳孔、虹膜清晰可见；2分为角膜浅层混浊，透过病灶可见瞳孔及虹膜；3分为角膜全层呈不均匀混浊，瞳孔及虹膜几乎不可见；4分为角膜均匀致密混浊，瞳孔及虹膜不可窥见。病灶面积[7]：1分为占角膜总面积1%～25%；2分为占角膜总面积>25%～50%；3分为占角膜总面积>50%～75%；4分为占角膜总面积>75%～100%。

1.3.4角膜上皮缺损面积的定量各组随机选取16只小鼠于造模后2 d、3 d、4 d、5 d分别用10 g·L-1荧光素钠行角膜染色，生理盐水冲洗，裂隙灯钴蓝光拍照，图像处理软件Photoshop CS6(13.0.1)定量各组小鼠角膜上皮缺损面积。

1.3.5角膜平铺片中性粒细胞、巨噬细胞染色及定量各组分别在造模后2 d、3 d、5 d各随机处死6只小鼠并取角膜，用40 g·L-1多聚甲醛固定液室温固定，修剪角膜保留角膜缘及完整的角膜组织，2 g·L-1Triton-BSA溶液室温破膜封闭，加入已配制抗体FITC/Gr-1或PE/F480，避光放置于4 ℃冰箱过夜，第2天进行角膜平铺片。用全自动数字切片扫描仪全景扫描荧光染色角膜整个铺片，对样品进行逐层扫描，各个层面进行3 D合成，用计算机图像分析软件Caseviewer(2.0)和Photoshop CS6(13.0.1)计量全角膜图像中特异性标记的荧光面积，也就是角膜中的中性粒细胞及巨噬细胞的面积。

1.3.6MPO活性测定每组分别在造模后2 d、3 d、5 d各随机处死8只小鼠，将各组小鼠角膜组织进行研磨，制备成组织浆液，离心后取上清，然后根据MPO试剂盒提示依次加入样本、各种试剂和显色液，最后将以上混合物置入1 cm直径比色皿中，在分光光度计460 nm波长下进行比色测定MPO活性。

2 结果

2.1双醋瑞因对小鼠角膜碱烧伤临床评分的影响碱烧伤造模后2 d，各组小鼠角膜中央均出现混浊，其混浊度为透过病灶可窥见瞳孔及虹膜。造模后3 d，生理盐水组角膜混浊进一步加重，病灶区瞳孔和虹膜纹理几乎不可见，双醋瑞因组和地塞米松组可窥见瞳孔。模型制作后前3 d各组小鼠角膜混浊度及病灶面积均逐渐增加，3 d时生理盐水组病灶面积最大，4 d时角膜病灶区呈灰白色，混浊度评分最高，之后混浊度及病灶面积均逐渐下降。地塞米松组及双醋瑞因组造模后3 d时临床评分最高，4 d时病灶面积及混浊度均下降，双醋瑞因组较地塞米松组下降明显，角膜病灶区呈云翳样改变。造模后5 d各组小鼠角膜临床评分均下降，生理盐水组角膜变化不明显，双醋瑞因组角膜临床评分下降显著，病灶区呈薄雾样，地塞米松组次之。双醋瑞因组及地塞米松组造模后4 d、5 d角膜临床评分较生理盐水组显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.01)；双醋瑞因组角膜临床评分与地塞米松组相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见图1和表1。

图1 碱烧伤模型造模后不同时间点各组小鼠角膜透明度及病灶面积表现

表1 碱烧伤后不同时间点各组小鼠角膜临床评分比较

注：与生理盐水组相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2双醋瑞因对小鼠角膜碱烧伤上皮愈合的影响造模后2 d双醋瑞因组小鼠角膜上皮愈合过半，3 d上皮缺损进一步减少，5 d小鼠角膜上皮基本愈合。造模后3 d，地塞米松组角膜上皮愈合约半，4 d缺损减少呈点片状，5 d上皮仍有部分缺损。生理盐水组造模后3 d角膜上皮缺损仍有过半，4 d角膜上皮愈合近半，5 d角膜上皮缺损面积较双醋瑞因组及地塞米松组大。角膜碱烧伤后各组小鼠角膜上皮愈合速率存在差异，造模后2 d、3 d、4 d、5 d双醋瑞因组较生理盐水组角膜上皮愈合较快，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；地塞米松组角膜上皮愈合较生理盐水组变化不明显。见图2和表2。

图2 碱烧伤后不同时间点各组小鼠角膜上皮缺损情况

表2 碱烧伤后不同时间点各组小鼠角膜裂隙灯下上皮缺损面积比较(n=16)

注：与生理盐水组相比，*P<0.05，**P<0.01；与地塞米松组相比，#P<0.01

2.3双醋瑞因对小鼠碱烧伤角膜炎症细胞的影响

2.3.1双醋瑞因对小鼠碱烧伤角膜中性粒细胞的影响造模后2 d各组小鼠中性粒细胞主要集中在角膜缘部位，生理盐水组角膜中性粒细胞数量较多，角膜缘绿色荧光条带明显较宽，地塞米松组次之，双醋瑞因组角膜缘绿色荧光条带较窄；造模后3 d中性粒细胞进一步向角膜旁中央及损伤区趋化，各组角膜缘血管旁中性粒细胞浸润均明显减少，生理盐水组较其他两组绿色荧光面积较大，双醋瑞因组及地塞米松组角膜旁中央及病灶区中性粒细胞浸润明显减少；造模后5 d各组小鼠中性粒细胞浸润进一步减少，双醋瑞因组角膜缘血管旁中性粒细胞消退明显，旁中央及损伤区绿色荧光面积较生理盐水组减小，呈点状散在分布，地塞米松组次之。3组小鼠角膜中性粒细胞定量结果见表3，双醋瑞因组角膜中性粒细胞造模后2 d、3 d、5 d均较生理盐水组浸润少，差异均有统计学意义(均为P<0.01)；各时间点地塞米松组角膜中性粒细胞浸润少于生理盐水组，差异有统计学意义。见图3和表3。

2.3.2双醋瑞因对小鼠碱烧伤角膜巨噬细胞的影响造模后2 d各组小鼠从角膜缘至角膜中央均可见少量巨噬细胞浸润，但巨噬细胞大多呈单个散在分布，且生理盐水组较双醋瑞因组及地塞米松组巨噬细胞分布密度高、红色荧光面积大；造模后3 d小鼠角膜缘和旁中央巨噬细胞迁入，双醋瑞因组及地塞米松组巨噬细胞增加相对较少，生理盐水组角膜缘红色荧光条带明显增宽，且角膜红色荧光面积较双醋瑞因组大，差异有统计学意义(P<0.05)；造模后5 d角膜缘和旁中央大量巨噬细胞涌入，迁移至角膜中央，生理盐水组角膜旁中央及病灶区大片巨噬细胞浸润，双醋瑞因组及地塞米松组较生理盐水组增加少，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4和图4。

图3 碱烧伤不同时间点各组小鼠角膜的中性粒细胞浸润情况。绿色为抗体FITC/Gr-1标记中性粒细胞

表3 碱烧伤不同时间点各组小鼠角膜中性粒细胞的定量(n=6)

注：与生理盐水组相比，*P<0.05，**P<0.01；与地塞米松组相比，#P<0.01

表4 碱烧伤不同时间点各组小鼠角膜巨噬细胞的定量(n=6)

注：与生理盐水组相比，*P<0.05，**P<0.01；与地塞米松组相比，#P<0.01

2.4双醋瑞因对小鼠碱烧伤角膜MPO的影响对各组小鼠不同时间点角膜MPO活性进行测定，结果发现，生理盐水组在各个时间点MPO活性均较高，双醋瑞因组及地塞米松组角膜MPO活性造模后2 d、3 d、5 d均较生理盐水组降低，差异均有统计学意义(均为P<0.01)。见表5。

图4 碱烧伤不同时间点各组小鼠角膜巨噬细胞浸润情况。红色为抗体PE/F480标记巨噬细胞

表5 碱烧伤不同时间点各组小鼠角膜MPO活性定量(n=8)

注：与生理盐水组相比，*P<0.01；与地塞米松组相比，#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

双醋瑞因是一种蒽醌衍生物，活性代谢产物为大黄酸，目前主要用于骨关节炎的治疗，通过抑制软骨基质的降解来缓解骨关节炎患者的疼痛和改善关节功能。双醋瑞因的主要作用机制是减少IL-1转化酶的产生来抑制IL-1β的激活和相关的下游信号转导，此外还可以减少基质金属蛋白酶、一氧化氮、IL-6等的产生[8]。因此，双醋瑞因具有显著的抗炎作用。而本研究将双醋瑞因配制成符合眼部药理要求的双醋瑞因滴眼制剂，通过小鼠角膜碱烧伤模型来研究其抗炎作用。

角膜碱烧伤是一种常见的化学性眼外伤，以持续性角膜上皮缺损及角膜溃疡为特征，角膜碱损伤后会引起严重的炎症反应，虽然角膜损伤的愈合需要一定程度的炎症，但是炎症细胞的持续存在会延迟角膜上皮再生，导致角膜基质层损伤并形成溃疡，最终留下不同程度的角膜混浊[9]。本研究结果表明，双醋瑞因可以降低角膜碱烧伤混浊度，缩小角膜碱烧伤病灶面积，促进角膜上皮的修复及减少角膜碱烧伤炎症细胞的浸润。还有研究表明[10]，角膜碱烧伤后受损的上皮及基质分泌促炎细胞因子，刺激角膜基质细胞释放Fas配体，诱导附近角膜细胞凋亡，随后角膜细胞、成纤维细胞及肌成纤维细胞活化，这些细胞一起恢复受损的角膜基质及上皮，而过度的炎症会增强肌成纤维细胞的活性，增强其纤维组织的沉积，随之发生角膜基质重塑，导致角膜混浊。因此，双醋瑞因可能减少相关炎症因子，降低肌成纤维细胞的活性，从而降低角膜混浊度及缩小病灶面积，具体机制还需进一步研究。

此外，角膜上皮被认为是识别病原体相关分子模式的第一道防御线，可以引发强烈的先天性免疫反应，上皮的愈合取决于上皮细胞的迁移和增殖，以及上皮基底膜的完整性[11]，并且受各种细胞因子、炎症细胞等的影响。在本研究中，局部应用双醋瑞因滴眼制剂可提高角膜上皮修复速度，我们猜测可能与双醋瑞因抑制炎症反应及促进细胞增殖有关。Toegel等[12]利用体外实验证明双醋瑞因可以促进软骨细胞合成细胞外基质，从而增加软骨细胞的增殖能力，且该过程与炎症因子IL-1β密切相关，该结论支持我们的猜想。

角膜碱烧伤时碱性物质与角膜接触造成组织的变性坏死，同时启动免疫炎症反应。近年来研究发现[13]，前炎症因子IL-1在角膜碱烧伤炎症的发生、发展过程中起重要作用，角膜遭受化学性物质损伤的早期，释放大量IL-1，发出趋化信号吸引中性粒细胞，其分泌相关调节因子及清除坏死物质，其后续效应可造成角膜溃疡。本研究得知，角膜碱烧伤后中性粒细胞开始向病变区游走，中性粒细胞首先自血管较为丰富的角膜缘向中央病变区定向聚集及浸润。本研究结果表明，双醋瑞因可以减少小鼠角膜缘及中央病变区中性粒细胞的浸润，其作用机制可能与IL-1有关。根据国外学者[14-15]研究证明，NLRP3-ASC-caspase-1-IL-1β炎症通路参与角膜碱烧伤炎症反应，在角膜碱烧伤后阻止该途径可以抑制其炎症反应，该结论与本研究预想结果一致。

MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志，其水平及活性变化代表着中性粒细胞的功能和活性状态。该酶具有使过氧化氢还原的能力，利用这一特点可以分析酶的活力，通过供氢体邻联茴香胺供氢后生成黄色化合物，在分光光度计460 nm处通过比色测定产物的生成量从而推算出MPO的活力和中性粒细胞的数目[16]。从研究结果来看，双醋瑞因组及地塞米松组小鼠MPO活性较生理盐水组低，且各组造模后2 d MPO活性最高，与本实验中性粒细胞的定量结果一致，但MPO活性于造模后5 d呈上升趋势，与本实验中性粒细胞定量随时间逐渐下降呈相反趋势。经进一步验证及相关文献得知，角膜碱烧伤后巨噬细胞于第1天开始增加，7～10 d达高峰，且与角膜新生血管形成密切相关，是角膜碱烧伤炎症反应的后期阶段[17]。而中性粒细胞是MPO含量最丰富的细胞，但MPO亦存在于巨噬细胞[18]，并有相关研究将其用于巨噬细胞活性测定[19]。故本研究又进一步对各组不同时间点巨噬细胞进行定量，该结果又进一步证实小鼠角膜碱烧伤MPO活性于造模后5 d因巨噬细胞增加呈上升趋势，且双醋瑞因组及地塞米松组较生理盐水组增加较慢，其具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，双醋瑞因作为一种IL-1抑制剂，可以减少小鼠角膜碱烧伤炎症细胞的浸润，改善角膜碱烧伤预后。