糖调节受损模型大鼠肝脏组织PPAR-γ、GLUT2、InsR mRNA表达水平及胰岛β-细胞超微结构变化

古丽娜扎尔， 艾比拜·玉素甫， 麦合苏木·艾克木

(1新疆医科大学维吾尔医学院， 乌鲁木齐 830011； 2新疆医科大学第一附属医院内分泌科， 乌鲁木齐 830054)

糖调节受损(Impaired glucose tolerance，IGT)即糖尿病前期，是介于正常血糖与糖尿病之间一种糖调节失衡表现，包括空腹血糖受损和糖耐量受损，是Ⅱ型糖尿病(T2DM)的主要危险因素[1]。调查表明我国20岁以上成年人IGT发病率为15.5%，IGT极易发展成为T2DM，若此阶段进行有效干预，可有效防止和延缓糖尿病(DM) 的发生、发展，减少微血管和大血管并发症[2]。IGT主要的病理生理基础是胰岛素抵抗(IR)和胰岛β细胞功能受损[3-4]。王东等[5]建立IGT模型研究空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)、胰岛素水平(Fasting serum Insulin，FINS)、葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance，OGTT)的变化及胰岛素抵抗指数(Homeostasis model insulin resistance index，HOMA-IR)和胰岛β-细胞功能指数(Pancreatic β-cell function index，HOMA-β)等。尚未见有关IGT模型PPAR-γ、GLUT2、InsR mRNA表达水平及胰岛β-细胞超微结构变化等研究报道。本研究通过灌胃高脂乳剂和腹腔注射小剂量链尿佐菌素(Streptozotocin，STZ)，建立IGT大鼠模型，并测定FBG、FINS、OGTT、计算HOMA-IR和HOMA-β的基础上，采用RT-PCR技术，检测肝脏组织中PPAR-γ、InsR及GLUT2 mRNA表达水平，利用透视电镜观察胰岛β细胞超微结构的变化，现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器DG-3022型酶标仪(美国Bio-Rad公司)，H2050R1型低温超速离心机(上海华岩仪器有限公司)，t100型RT-PCR仪(美国Bio-Rad公司)， AF100型制冰机(美国Scotsman公司)，768/07865凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)，三诺GA-3血糖仪(泰博科技股份有限公司)。

1.2试药大鼠胰岛素酶联免疫试剂盒(华美生物工程有限公司，批号CSB-E05070r)，生理盐水(国药集团新疆制药有限公司，批号100103473)，盐酸二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，批号110807A)，链脲佐菌素(美国Sigma 公司，批号GX72-1000)、cDNA合成试剂(英国Thermo 公司，批号1622)，TRNzol Universal总RNA提取试剂(天根生化科技公司，批号DP140901)，DEPC-treated water(上海生工试剂有限公司)，2×Taq Plus PCR 试剂(天根生化科技公司，批号KT121221)，氯仿(上海试剂厂，批号20170625)，异丙醇(上海试剂厂，批号20171216)，无水酒精(北京赛奥科技有限公司，批号20170521)。

1.3实验动物选取SPF级别的雄性Wistar大鼠20只，体质量(180±20)g，由新疆医科大学动物实验中心提供[许可证号：SCXK(新)2016-0002]。

1.4高脂饲料与药物配制

1.4.1 高脂饲料的配制 取猪油1 000 g、胆固醇500 g、猪胆酸盐100 g、丙基硫氧嘧啶50 g、吐温-80 1 000 mL、丙二醇1 000 mL、加蒸馏水5 000 mL混匀即得。

1.4.2 药物的配制 (1)柠檬酸盐缓冲液的配制：A液取柠檬酸钠2.94 g置于100 mL 容量瓶，加蒸馏水定容至100 mL；B液取柠檬酸2.1 g置于100 mL容量瓶，加蒸馏水定容至100 mL；将A液与B液按1∶1.32混合均匀，PH调节至4.2，即得柠檬酸盐缓冲液。(2)STZ溶液的配制：取STZ 1 g，避光，4℃下，以pH为4.2 的0.1 mmol/L柠檬酸盐缓冲液配制1%STZ的溶液。

1.5动物分组与模型建立方法选取SPF级别的雄性Wistar大鼠20只，随机分为对照组和模型组。模型组：灌胃高脂饲料2 mL/只、每天1次，连续32 d，于第33 d禁食、水8 h后，腹腔注射STZ 25 mg/kg。对照组以生理盐水代替高脂饲料，以柠檬酸钠缓冲液代替STZ。

1.6标本的采集及指标测定方法

1.6.1 大鼠血液样本的采集及FBG、FINS、OGTT的测定 实验第33 d更换大鼠笼子，大鼠自由进食、水8 h，12 h后大鼠尾巴末端取血，血糖仪快速测定FBG。大鼠灌胃葡萄糖(2.5 g/ kg体质量)，用血糖仪分别测定灌胃后30、60、120 min时大鼠的血糖浓度值(OGTT)。大鼠眼静脉丛取血1 mL按照大鼠胰岛素(FINS)酶联免疫试剂盒说明，测定大鼠空腹FINS，计算HOMA-IR、HOMA-β，计算公式为：HOMA-IR=FBG×FINS/22.5，HOMA-β=20×FINS/(FBG-3.5)。

1.6.2 大鼠肝脏样本的采集及PPAR-γ、GLUT2、InsR mRNA表达水平的测定 取大鼠肝脏组织30～50 mg，置于无RNA酶的EP管中，在通风的情况下，每管依次加入l mL TRNzol Universal试剂，匀浆处理，室温放置5 min。各管中加入氯仿200 μL并颠倒混匀15 s，室温放置3 min，以4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清液，加入等体积的异丙醇500 μL，室温放置10 min，以4℃ 12 000 r/min离心10 min。离心后可见沉淀于管底的白色RNA，弃去上清液，保留沉淀。将沉淀用1 mL 75%的乙醇清洗，以4℃，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，保留沉淀，干燥后用50μL RNase-Free ddH20将RNA充分溶解，-20℃冰箱保存，待用。取1 μL RNA检测RNA样品260 nm和280 nm处的吸光度(OD)。逆转录合成cDNA，反应体系的配置：取DNAse、RNase-free (EN0521)、Total RNA、10×Reaction Buffer with MgCl2各1 μL，用RNAse 定容至10 μL。反应条件：37℃，30 min，再向反应体系中加入50 mmol/L的 EDTA1 μL，65℃下反应10 min，反应结束后取出置于冰上作为逆转录酶的模板。向消化DNA后的RNA反应管中加入如下体系：Oligo dT 18 primer 1 μL，10 mmol/L dNTP mix 2 μL，反应缓冲液4 μL，抑制剂 1 μL， M-MuLV反转录酶1 μL，总体积为20 μL。反应条件：42℃，60 min；70℃，5 min；待温度降至4℃取出保存。此时为反转录后的单链cDNA，可直接进行PCR或-20℃保存备用。以反应缓冲液将逆转录cDNA反应生成的cDNA稀释1∶1 000，并添加以下试剂，反应体系为25 μL。吸取cDNA模板1 μL，上游引物F 1 μL，下游引物R 1 μL，2×Taq Plus PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 水 9.5 μL，总体积为25 μL。反应条件：共30个循环(每个循环后自动读板 1次)，每个引物相应的退火温度上退火，94℃ 3 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃延伸1 min，做55℃～95℃的融解曲线分析。每个样品做3 个平行管。mRNA相对表达量= 2-ΔCT×100%，ΔCT=目标基因CT值-内参(GAPDH)CT值。cDNA片段的PCR引物序列，见表1。

表1 用于合成cDNA片段的PCR引物序列

1.6.3 大鼠胰腺样本的采集及胰岛β-细胞超微结构的观察 取出大鼠肝脏及胰腺组织，将胰腺组织切成花1 mm×1 mm×1 mm小块，立即放入2.5%戊二醛固定液固定，用0.1 mol/L PBS缓冲液漂洗3次，10 min/次，再用1%戊二醛固定液固定2 h，逐级丙酮脱水，石蜡包埋、切片，取用普通载玻片制作的胰腺组织切片，经二甲苯脱蜡2次、每次5 min，无水乙醇2次、每次2 min，95%、85%、75%乙醇各1次、每次1 min，用水浸洗2 min，逐级水化后浸入苏木精染液5 min，自来水浸洗1 min，浸入1 %稀盐酸酒精溶液分色20 s，用水浸洗1 min，浸入1%氨水中反应30 s，用水浸洗1 min，浸入伊红染液5 min，用水浸洗1 min，再分别用75%、85%、95%乙醇各浸洗1次、每次1 min，无水乙醇浸洗2次，每次2 min，逐级脱水后，用二甲苯透化2次，每次5 min，中性树胶封片，于镜下观察、拍照记录结果。

2 结果

2.12组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR以及HOMA-β的比较与对照组比较，模型组大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR升高，HOMA-β降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.22组大鼠不同时间点血糖的变化与对照组相比，模型组大鼠糖负荷后30、60、120 min时的血糖值均升高，其中大鼠糖负荷后60 min时的血糖值最高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 2组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR以及HOMA-β的比较

注：与对照组相比较，*P<0.05、**P<0.01。

表3 2组大鼠不同时间点血糖的变化

注：与对照组相比，*P<0.05、**P<0.01。

2.32组大鼠胰岛β-细胞超微结构的比较对照组大鼠胰岛β-细胞核膜完整，核染色体分布均匀，胞质内线粒体、粗面内质网和高尔基复合体丰富而发达、有大量的分泌颗粒，为圆球形，颗粒内有电子密度不一的芯，界膜与芯之间的间隙较大，明亮清晰，细胞核形状为圆形或卵圆形，较大，核膜光滑。与对照组比较，模型组大鼠胰岛β-细胞胞质内线粒体、粗面内质网和高尔基复合体数量减少，线粒体、粗面内质网和高尔基复合体部分肿胀，胞浆中分泌颗粒数量和致密芯密度略减低，见图1。

对照组(电镜，×12 000倍) 模型组(电镜，×15 000倍)

2.42组大鼠肝脏组织中PPAR-γ、GLUT-2及InsRmRNA的表达与对照组比较，模型组大鼠肝脏组织中PPAR-γ、GLUT-2及InsR mRNA表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 2组大鼠肝脏组织中PPAR-γ、GLUT-2及InsR mRNA的表达水平

3 讨论

IGT即糖尿病前期是糖代谢紊乱而产生的病理状态，是T2DM的主要危险因素，其发病原因至今尚未完全阐明。目前糖尿病模型的相关研究主要集中在T2DM模型的建立技术和方法等[6-7]，IGT模型分子机制等方面的研究报道甚少，其分子机制尚未清楚。建立IGT模型并探讨可能的分子机制对糖尿病和IGT的发病因素、发病过程及防治等方面具有重要意义。本实验采用灌胃高脂乳剂和腹腔注射小剂量STZ，建立IGT大鼠模型[8-11]，采用RT-PCR技术，检测肝脏组织中PPAR-γ、InsR及GLUT2 mRNA表达水平，利用透视电镜观察胰岛β细胞超微结构的变化。通过对IGT模型大鼠β细胞超微结构变化观察可见，与对照组相比，模型胰岛β-细胞胞质内线粒体、粗面内质网和高尔基复合体数量减少，线粒体、粗面内质网和高尔基复合体部分肿胀，胞浆中分泌颗粒数量和致密芯密度略减低，说明IGT模型胰岛β-细胞结构变化导致其功能紊乱。IGT模型胰岛β-细胞功能紊乱特征与临床糖调节受损病理生理特征一致。

PPAR-γ是胰岛素抵抗、糖代谢调节因子之一，主要作用是改善胰岛素抵抗，增加外周组织对胰岛素的敏感性，从而促进葡萄糖的摄取[12-13]。葡萄糖转运体(GLUT)是一类调控细胞外葡萄糖进入细胞内的跨膜蛋白家族，参与糖代谢，炎性反应和免疫应答等过程。GLUT2作为GLUT蛋白亚型，具有很高的转运能力，其高表达能改善肝葡萄糖摄取和利用[14-15]。Ins是机体内不可缺少的蛋白质激素，由胰腺胰岛β-细胞分泌，促进细胞的增殖，分化。Ins和InsR结合后才能发挥降低血糖的作用，Ins和InsR结合过程任何一个环节受损，都会引起胰岛素抵抗。从实验结果可推测，IGT模型大鼠FBG、FINS、OGTT等糖代谢指标异常可能与PPAR-γ、GLUT-2及InsR mRNA表达水平下降有关。本研究不仅为IGT模型分子机制的初步探讨，也为糖调节受损发病机制及干预手段研究奠定基础。