基于ND2基因的崖沙燕遗传多样性和遗传结构初探

安博洋 安 月 王兰芝 李 波，2*

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040；2.国家林业和草原局野生动植物检测中心，哈尔滨，150040)

遗传多样性指地球上生物携带的所有遗传信息，是生物多样性的基础和核心[1-2]。物种遗传多样性越丰富，其进化潜力越强，越能适应环境的变化。研究物种的遗传多样性，有利于了解该物种的遗传结构及进化历史，是制定物种保护和种质资源开发利用策略的前提[3]。

崖沙燕(Ripariariparia)隶属于雀形目(Passeriformes)燕科(Hirundinidae)[4]，分布于除澳大利亚地区外的各个国家，在中国主要见于东北区、蒙新区及西南区[5-6]。崖沙燕在世界范围内分为3个亚种：主要分布在欧亚大陆、美洲的指名亚种(R.r.riparia)，主要分布在远东地区，从中国东部到东南亚的东北亚种(R.r.ijimae)，主要分布在埃及、以色列的埃及亚种(R.r.shelleyi)[7]。崖沙燕及其近缘物种的种群遗传多样性和遗传结构引起了学者们的关注。Alexandra和Manuel利用NADH脱氢酶第二亚基(NADH dehydrogenase subunit 2，ND2)、肌肉特异性酪氨酸激酶Z连锁基因第3内含子(Z-linked intron 3 of the muscle-specific tyrosine kinase，MUSK I3)及β-纤维蛋白原基因第7内含子(autosomal intron 7 of the beta-fibrinogen gene，fib7)研究了崖沙燕和淡色崖沙燕(Ripariadiluta)的系统发育关系和种群遗传结构[7-8]。结果表明崖沙燕与淡色崖沙燕的分歧发生在大约3.07百万年前(Mya)；所有崖沙燕个体聚集在同一支，而淡色崖沙燕分为两个姐妹枝(中西伯利亚和蒙古)；北美和远东的崖沙燕最早进行扩张，中西伯利亚的淡色崖沙燕进化历史最短[7-8]。上述研究所采用的崖沙燕样品主要来自欧洲、北美及中东地区，缺少中国东北地区的样品信息。

ND2基因作为线粒体电子传递复合体的组分之一，具有更快的进化速率[9]，能反映出种群间遗传关系差异，已经广泛应用于鸟类种群遗传和系统发育关系分析[10-13]。本研究测定了来自中国东北地区的崖沙燕东北亚种的ND2基因部分序列。结合GenBank中整理的国外崖沙燕ND2基因序列，探究崖沙燕3个亚种种群的遗传多样性和种群间遗传结构，剖析其原因，为进一步开展崖沙燕的分子生物学研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究收集了产自齐齐哈尔市沙龙区的50只崖沙燕肌肉组织，样本均由国家林业和草原局野生动植物检测中心提供。同时从GenBank中下载104条崖沙燕的ND2基因同源序列。根据崖沙燕各亚种的地理分布情况，将所有样本划分为3个亚种种群(表1)。另外，在进行系统发育分析时，采用淡色崖沙燕(序列编号：MG881123)作为外群。

表1 崖沙燕ND2基因序列

Tab.1 ND2 gene sequences of Riparia riparia

续表1

注：*标注的登录号来自Manuel[7]；其余登录号来自Alexandra[8]；编号个体由本实验扩增获得

Note：* Marked accession numbers from Manuel[7]，and the others are from Alexandra[8].Numbered individuals obtained from this experiment

1.2 PCR扩增与测序

肌肉样本经过预处理后经蛋白酶K消化，利用基因组DNA提取试剂盒(AxyPrep Biosciences，杭州)抽提和纯化总DNA。崖沙燕ND2基因的扩增使用引物为ASN(5′-GATCRAGGCCCATCTGTCTAG-3′)和MET-L(5′-AAGCTAT CGGGCCCATACCCG-3′)[14]。PCR反应在50 μL体系中进行，包括2×EasyTaqSuperMix(Transgen，北京)25 μL，正反向引物各1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 18 μL，DNA模板5 μL。扩增采用PE-9700型和2400型DNA扩增仪(PE，美国)，反应程序为94℃/3 min；(94℃/30 s，58℃/30 s，72℃/1 min 30 s)30 cycles；72℃/5 min。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离(80 V稳压、40 min)。凭借紫外灯切下目的条带，后用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化回收，将回收产物送至哈尔滨博仕生物工程技术有限公司，采用原引物进行双向测序。

1.3 数据分析

将每条序列用DNAstar软件包中的SeqMan进行校对，根据测序峰图，舍弃两端低信号序列，对序列内部位点进行人工校对。在Clustal W上将所得序列进行比对。利用MEGA 5.0[15]计算碱基组成、统计变异位点和遗传距离等。利用Dnasp 5.0[16]确定单倍型并计算核苷酸多样性(Nucleotide diversity，Pi)，单倍型多样性(Haplotype diversity，Hd)及平均核苷酸差异(Average number of nucleotide differences，K)。利用Arlequin 3.0[17]的分子变异分析AMOVA(Analysis of Molecular Variance)估算种群间/内的遗传分化指数(FST)。

根据Pavlova和Alexandra划分的地理格局将崖沙燕3个亚种分为6个地理种群：东北亚种分成东西伯利亚种群和远东种群；指名亚种分成欧洲种群、北美种群以及西西伯利亚种群；埃及亚种为以色列种群[7-8]。利用Mrmodeltest 2.3[18]根据AIC(Akaike Information Criterion)选择最佳核苷酸替代模型(GTR+G)，基于该模型在MrBayes 3.1.2[19]中构建系统发育树(BI)，主要参数包括：将马尔可夫链运行2 000 000代，每100代记录1次树，舍弃最先生成的25%的树，由后验概率(posterior probabilities，PP)评价其置信度。利用iqtree[20]构建ML(Maximum Likelihood)树，最佳核苷酸替代模型TN+G4，自举检验值由1 000次重复检验获得。

2 结果

2.1 线粒体ND2基因片段序列特征及遗传多样性

实验测得50条来自中国东北的崖沙燕ND2基因序列，结合GenBank中下载的序列，共计154条ND2基因部分序列(922 bp)。平均碱基组成为：22.7%T、35.9%C、31.2%A、10.2%G，A+T含量(53.9%)略高于C+G含量(46.1%)，结果与其他脊椎动物mtDNA碱基组成特点一致[21]。在922 bp中包含66个变异位点(7.16%)，其中23个为简约信息位点，43个为单突变位点。序列转换颠换比为19.75，没有出现碱基插入/缺失现象。

崖沙燕各亚种种群及总体单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(Pi)及平均核苷酸差异(K)等信息见表2。总体的单倍型多样性为(0.885±0.019)，核苷酸多样性为(0.002 92±0.000 18)，平均核苷酸差异为2.692。其中单倍型多样性最高为埃及亚种(0.905)，最低为东北亚种(0.776)。核苷酸多样性最高为埃及亚种(0.003 41)，最低为东北亚种(0.002 38)。通过Tajima’sD值检测东北亚种及指名亚种种群差异极显著P<0.01，拒绝零假设，表明进化不遵循中性模型，发生过种群扩张。

表2 崖沙燕3个亚种ND2遗传多样性

Tab.2 Riparia riparia 3 subspecies genetic diversity based on ND2 gene

注：*代表差异极显著P<0.01

Note：* Represents that the difference is extremely significant(P<0.01)

2.2 单倍型分布与系统发育分析

50只崖沙燕中定义了18个ND2单倍型，其中11个为新的ND2单倍型序列(H35-36、H38-43、H46-48)，结合GenBank中的104条崖沙燕序列共分为62个单倍型(H1-H62，表1)。在崖沙燕东北亚种与指名亚种中检测出2个共享单倍型(H4、H25)，埃及亚种与其他两个亚种间不存在共享单倍型。在62个单倍型中H1出现频率最高(43/154)，其次是H4(29/154)。

基于最大似然树(ML)及贝叶斯树(BI)构建崖沙燕ND2系统发育树(图1)，除置信度不同外，两种树的拓扑结构大致相同。结果显示：3个亚种的单倍型交错分布，亚种间没有的差异性，同时6个地理种群也没有形成独立的分支。其中东北亚种H60、H39与H45；H59与H61；H33与H49；H43与H52；H35与H41，指名亚种H12、H17与H20，埃及亚种H28与H29；H31与H32的亲缘关系较近。

2.3 种群间遗传分化

6个地理种群中崖沙燕ND2基因序列的遗传变异的分子变异分析(AMOVA)见表3，72.82%的遗传变异发生在种群内，而种群间变异占总变异的27.18%，说明变异主要发生在种群内。各地理种群间的遗传分化指数(FST)及遗传距离的结果见表4。其中，东北亚种的东西伯利亚种群与指名亚种的欧洲种群、北美种群及西西伯利亚种群的FST和埃及亚种的以色列种群与指名亚种中的西西伯利亚种的FST都小于0.2，表明该种群之间的遗传分化不显著。同时，各种群间的遗传距离在0.002—0.005，表明没有形成中级分化[22]。

3 讨论

核苷酸多样性(Pi)和单倍型多样性(Hd)是衡量种群遗传多样性的两个重要指标[23]。其中，Pi值考虑了各种在群体中所占的比率，因此更容易反映一个群体的mtDNA的多态程度[24]，Pi越大群体的多态程度越高。本研究中崖沙燕整体的Pi值为0.002 9(表2)，小于淡色崖沙燕的Pi值(0.004 2)[8]。

图1 基于ND2基因单倍型构建的崖沙燕系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of Riparia riparia based on haplotype sequence variation of partial ND2 sequences 注：分支上的数字分别表示ML树的自举值和BI树的后验概率(低于60%的数值没有显示)；淡色崖沙燕作为外群；黄色线为东北亚种的单倍型、红色线为指名亚种的单倍型、蓝色线为埃及亚种的单倍型、橙色线为东北亚种与指名亚种的共享单倍型；系统发育树后方为崖沙燕各地理种群的单倍型分布。红星表示本次实验所提取的中国东北地区崖沙燕单倍型 Note：The numbers on the branch represent the bootstrap value of the ML tree and the posterior probability of the BI tree(the values below 60% are not shown).Riparia diluta is the outgroup.The yellow lines are the haplotypes of R.r.ijimae；the red lines are the haplotypes of R.r.riparia；and the blue lines are the haplotypes of R.r.shelleyi；the orange lines are shared haplotypes of the R.r.ijimae and R.r.riparia.The haplotype distribution of the geographical populations of Riparia riparia is behind the phylogenetic trees.Red stars represent the Riparia riparia haplotypes in Northeast China

表3 崖沙燕不同种群遗传变异的分子变异分析(AMOVA)

Tab.3 AMOVA analysis of ND2 sequences in different populations of Riparia riparia

表4 崖沙燕种群间的遗传分化指数和遗传距离

Tab.4 Differentiation index(FST)and genetic distance between Riparia riparia populations

这说明崖沙燕的遗传多样性处于相对较低的水平。遗传多样性越低，该种群对环境适应的能力就越弱。自20世纪60年代以来崖沙燕遭受过几次大规模的种群崩溃(population crashes)事件[25]。欧洲部分国家已经将崖沙燕列入世界自然保护联盟的濒危物种名录[26]。早期的环志发现崖沙燕的重捕率非常低，特别是幼鸟，表明它的生存率可能较低。Edward认为这与栖息地降雨量有很大关系，较大的降雨量不仅降低了成鸟的食物资源丰富度，某种程度上也导致崖沙燕巢洞的崩塌[27]。可见栖息环境容易影响崖沙燕种群遗传多样性水平。为防止崖沙燕种群遗传多样性进一步降低，可以通过保护其栖息地来实现。例如西欧、北美的一些国家为崖沙燕制造出人工的悬崖，以方便其筑巢生活[26]。

崖沙燕3个亚种的形态上存在一些差异，例如：埃及亚种的体型较其他亚种小，东北亚种上咽部无黑斑等[7]。本研究增加了中国东北地区的崖沙燕样本，从中发现了11个新ND2单倍型序列。结合前人发表的序列，基于最大似然法和贝叶斯法构建的崖沙燕ND2单倍型系统发育树(图1)。结果表明各地理种群和亚种间都没有形成有效的独立分枝，这与Manuel和Alexandra的结果一致[7-8]。根据遗传分化指数与基因流的关系FST=1/(4Nm+1)，Nm小于1，表明群体由于遗传漂变产生遗传分化；Nm大于1，基因流水平较高，遗传分化较小；Nm大于4，则群体间基因流更加充分。从遗传分化给出的数据显示，同一亚种的不同地理种群间，以及不同亚种的不同种群间大多都有着较高的基因流，这导致了崖沙燕的线粒体基因差异较小。

崖沙燕种群间较高水平的基因流可能与其进化历史和迁徙行为有关。在末次冰期冰盛期时，西伯利亚的崖沙燕扩散到欧洲，海平面的降低使白令陆桥出现促进北美和欧亚大陆崖沙燕的基因流动。后冰期陆桥消失使远东与北美之间的基因流关闭[8]，解释了远东与北美的FST值(表4)相对较大。其次，崖沙燕是一种长距离迁徙候鸟[28]，有着多样的迁徙路线[29]，有3个主要的越冬地区：南美洲，撒哈拉以南的非洲和印度次大陆。其中，西伯利亚及远东地区的鸟类会迁徙至印度次大陆，而欧洲的鸟类会迁徙至印度次大陆及撒哈拉沙漠以南的非洲，而北美地区的鸟会迁徙至南美洲[28]。研究表明来自中欧东欧的崖沙燕广泛分布于地中海盆地和非洲东部南部，以及撒哈拉沙漠以南的萨赫勒地区[30]。这说明不同地理种群的崖沙燕有相互重叠的越冬区。重叠的越冬区使各地区之间有着高水平的基因流(东西伯利亚-欧洲、东西伯利亚-西西伯利亚和西西伯利亚-以色列)。埃及亚种与其他两个亚种之间的FST值较大(表4)，仅欧洲的种群与其基因分化指数相对较小，说明崖沙燕埃及亚种相对独立，仅与来自欧洲迁徙到非洲的崖沙燕指名亚种有一定的基因交流[30]。

由于线粒体有母系遗传的特点，缺乏其他分子标记辅助、单一的ND2基因分析只能初步地反映崖沙燕的种群遗传结构。对崖沙燕的种群遗传结构的深度剖析，还需要配合相关遗传学方面的研究证据。