炎症性肠病患者P2X7嘌呤受体及肥大细胞类胰蛋白酶表达研究

王丹丹， 杨贝贝， 王许平， 高 闯， 杜晓博， 耿 丽， 张目涵， 冯百岁

郑州大学第二附属医院消化内科 郑州大学第二附属医院暨炎症性肠病中心 吴阶平医学基金会炎症性肠病联盟河南省炎症性肠病中心，河南 郑州 450014

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种自身免疫性疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC) 和克罗恩病(Crohn’s disease, CD)两种类型[1]。研究显示，P2X7嘌呤受体是IBD发病中的重要“炎症参与者”，尤其是在CD患者中，表达P2X7嘌呤受体的肥大细胞显著增加[2]。P2X7嘌呤受体属于配体门控离子通道，可被ATP、ADP、UTP、UDP激活。P2X7嘌呤受体与炎症密切相关，且在肥大细胞上广泛表达，人体不同部位肥大细胞表达P2X7嘌呤受体的程度不同，肠道部位的肥大细胞高表达P2X7嘌呤受体。目前研究证实，ATP/P2X7信号介导肥大细胞的激活加重肠道炎症，肥大细胞被激活后，脱颗粒释放多种促炎细胞因子，如类胰蛋白酶，进而启动异常免疫应答，诱发IBD，但有关其与IBD的关系研究较少[3]。本研究通过检测P2X7嘌呤受体及类胰蛋白酶在IBD中的表达水平及表达相关性，探讨其在IBD发病中的作用，可能对IBD的诊断和治疗有一定的指导作用。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2016年12月至2018年3月于郑州大学第二附属医院住院的80例活动期IBD患者的肠组织活检石蜡包埋标本及血清样本，诊断标准参考《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》[4]。UC采用改良Truelove和Witts疾病严重程度分型标准，其中轻度UC患者15例；中度UC患者20例；重度UC患者23例。CD采用克罗恩病活动指数(CDAI)评估疾病活动性的严重程度，其中轻度CD患者7例；中度CD患者7例；重度CD患者8例。各组患者的年龄及病史见表1。40例肠组织对照组取自结直肠癌患者外科手术切除的癌旁组织，经病理证实均为正常组织，年龄(60.8±12.8)岁(32～86岁)。40名健康志愿者的血清样本，年龄(34.0±9.3)岁(25～52岁)。本研究方案经过医师伦理委员会批准，入组患者均签署知情同意书。

表1 各组患者年龄及病史的比较Tab 1 Comparison of the age and history of the disease among each group

1.2免疫组织化学法石蜡切片经脱蜡，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，封闭，滴加兔多克隆P2X7/P2RX7抗体(美国Novus公司)(稀释度为1∶500)，滴加反应增强液，滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物，DAB显色，苏木素复染，质量浓度为10 g/L盐酸-酒精分化、脱水、透明、封片。各步骤之间用PBS冲洗3次，每次5 min。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。阳性判断标准：胞浆内或胞核内出现棕褐色颗粒的细胞为阳性细胞，一般根据染色广度和染色强度对所观察的切片进行分级，在光学显微镜高倍视野(400×)下阅片，选择无边缘效应、无组织折叠等影响阅片效果的典型部位，随机选取5个不重复视野，每个视野计数100个细胞，取每个视野内的平均阳性细胞数作为计数标准，每个切片分别由2名病理科医师计数，在双盲下行结果评分判断。阳性细胞所占百分比：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕色或棕黄色为2分，棕褐色或褐色为3分。两者记分相乘即阳性等级：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.3ELISA检测血清中类胰蛋白酶的含量清晨空腹抽取3 ml静脉血，离心取血清冻存，以便分批检测。血清经加样、弃去液体、加检测溶液A工作液、洗涤、加检测溶液B工作液、洗涤、加TMB底物溶液、加终止溶液、酶标仪测量各孔光密度值等步骤检测血清中类胰蛋白酶的含量，试剂盒购自武汉优尔生商贸有限公司，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4粪钙卫蛋白(FC)检测各组患者采集5～10 g粪便，粪便标本于-20 ℃保存，72 h内检测FC含量，采用ELISA法进行检测，试剂盒购自武汉优尔生商贸有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1UC患者肠组织中P2X7嘌呤受体的表达图1显示了对照组、轻度UC组、中度UC组、重度UC组肠组织中P2X7嘌呤受体的表达。结果表明，各分组的阳性率分别为17.5%(7/40)、53.3%(8/15)、75.0%(15/20)、91.3%(21/23)。UC患者各亚组P2X7嘌呤受体均高于对照组(χ2=7.062，P=0.008；χ2=18.983，P<0.05；χ2=32.216，P<0.05)，其中，重度UC组高于轻度UC组(χ2=7.242，P=0.007)。

2.2CD患者肠组织中P2X7嘌呤受体的表达对照组、轻度CD组、中度CD组和重度CD组的阳性率分别为17.5%(7/40)、57.1%(4/7)、57.1%(4/7)、75.0%(6/8)。CD患者各亚组P2X7嘌呤受体均高于对照组(χ2=5.223，P=0.022；χ2=5.223，P=0.022；χ2=11.161，P=0.001)，而CD亚组间比较,差异无统计学意义(P>0.05，见图2)。

图1 UC患者各组肠组织中P2X7嘌呤受体的表达(400×) A: 对照组；B：轻度UC组；C：中度UC组；D：重度UC组；图2 CD患者各组肠组织中P2X7嘌呤受体的表达(400×) A: 对照组；E：轻度CD组；F：中度CD组；G：重度CD组

2.3各组患者血清中类胰蛋白酶的表达血清类胰蛋白酶的表达在IBD患者组高于对照组,且重度IBD组高于轻、中度IBD组，差异有统计学意义(P<0.005，见表2)。

2.4P2X7嘌呤受体与类胰蛋白酶表达的相关性分析经Pearson相关性分析，UC患者肠组织中P2X7嘌呤受体的表达与血清中类胰蛋白酶的表达呈正相关(r=0.872，P<0.05)；CD患者肠组织中P2X7嘌呤受体的表达与血清中类胰蛋白酶的表达呈正相关(r=0.866，P<0.05)。

2.5P2X7嘌呤受体与FC含量的相关性分析图3显示了IBD患者各组P2X7嘌呤受体免疫组化评分与FC含量的相关性，Pearson相关性分析表明，IBD患者肠组织中P2X7嘌呤受体的表达与FC含量呈正相关(r=0.543，P<0.05)。

表2 各组患者血清类胰蛋白酶表达水平的比较

注：F=12.531，P<0.001；与对照组比较，*P<0.05；与轻、中度UC组比较，#P<0.05；与轻度、中度CD组比较，△P<0.05。

图3 IBD患者P2X7嘌呤受体与FC的相关性分析

3 讨论

IBD是一种病因及发病机制尚不十分清楚的慢性、复发性肠道炎症性疾病，包括UC和CD两种类型，可致腹痛、腹泻、便血等临床症状[1]。多数学者认为异常免疫应答是其发病的主要原因，多种细胞参与肠道的免疫活动，如散在分布于肠黏膜固有层的肥大细胞、巨噬细胞及自然杀伤细胞等，它们能够及时清除病原体，从而维持肠道内环境的稳定[5]。

ATP作为组织损伤的局部信号，由活化的免疫细胞和损伤细胞[6]非特异性地释放到细胞外间隙[7]。ATP作为典型的与损伤相关的分子模式信号，通过肥大细胞上表达的P2X7嘌呤受体传导信号，对炎症的激活至关重要[8]。嘌呤信号通路通过以下三个机制在肥大细胞脱颗粒中发挥作用：(1)高浓度ATP通过P2X7嘌呤受体直接诱导脱颗粒；(2)低浓度ATP通过P2X4嘌呤受体[9]活化增强FcεRI介导的脱颗粒；(3)在胞外核苷酸酶富集环境中，ATP和转化产物腺苷通过P1和P2受体共同激活诱导协同脱颗粒[10]。

研究[2]证实，IBD患者中P2X7嘌呤受体的表达增加。本研究发现，UC组P2X7嘌呤受体的表达高于对照组，且重度UC组高于轻度UC组,差异有统计学意义。CD组P2X7嘌呤受体的表达高于对照组，差异有统计学意义，而CD患者各亚组间比较,差异无统计学意义,可能与样本量少有关。P2X7嘌呤受体激活后可形成非选择性阳离子通道，导致钙通量增加，使肥大细胞脱颗粒释放多种炎性介质，促进炎症的发生[11]。FC在肠道发生炎症时含量升高，可作为评价IBD疾病活动性的指标[12]。本研究显示，P2X7嘌呤受体与FC呈正相关，提示P2X7嘌呤受体可能与炎症的发生密切相关。此外，有资料显示，在实验性肾小球肾炎、类风湿性关节炎等炎性疾病中，应用P2X7嘌呤受体拮抗剂或特异性敲除P2X7受体可以显著改善患者临床症状[13]。因此，抑制P2X7嘌呤受体具有潜在临床价值。

肥大细胞是炎症性疾病及过敏性疾病的效应细胞，在宿主-环境界面充当“哨兵”，通过释放促炎介质增强上皮分泌、蠕动，及时清除细菌、病毒、寄生虫及过敏原[14]。人类肥大细胞根据其蛋白酶种类分为两种亚型：类胰蛋白酶阳性、糜蛋白酶阴性亚型(MCT)；类胰蛋白酶、糜蛋白酶双阳性亚型(MCTC)，前者主要位于黏膜固有层，后者主要位于黏膜下层、肌层及浆膜层。类胰蛋白酶存在于两种肥大细胞中，因此可以看作是肥大细胞激活及脱颗粒的标志[5]。本研究发现，类胰蛋白酶在各组外周血的表达差异有统计学意义,IBD组高于对照组,且重度IBD组高于轻、中度IBD组。另外，P2X7嘌呤受体与类胰蛋白酶呈显著正相关，提示P2X7嘌呤受体可能通过激活肥大细胞，增加类胰蛋白酶的表达，参与IBD的发生、发展。

综上所述，P2X7嘌呤受体在IBD中表达增加，可能通过诱导肥大细胞活化，增加炎症因子如类胰蛋白酶的分泌，从而参与IBD的发病。因此，进一步研究P2X7嘌呤受体信号通路，将有利于进一步理解IBD的发病机制，并为其治疗提供新的方法。