延边白鹅CD4与CD8基因SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立与应用

王美淇，李远超，李文佳，陈 姗，孟 媛，刘晋宇，高 旭

(延边大学 农学院动物医学系，吉林 延吉133000)

淋巴细胞源于骨髓干细胞，后分化为B淋巴细胞和T淋巴细胞，分别负责体液免疫和细胞免疫[1]。禽类B淋巴细胞在法氏囊内分化成熟，而T淋巴细胞在胸腺中完成分化，B淋巴细胞负责体液免疫，T淋巴细胞负责细胞免疫[1]。CD4与CD8分子是T淋巴细胞表面的两个主要抗原受体，CD8淋巴细胞又称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，接受MHC I类分子递呈的抗原，直接杀伤靶细胞清除外源病原体；CD4淋巴细胞又称为辅助性T淋巴细胞(Th)，主要依赖分泌多种细胞因子来应对外源抗原的侵袭，接受MHC II类分子递呈的抗原[2]。CD4是一个单体蛋白，而CD8则由两个不同蛋白组成，即α链和β链，经二硫键连接形成αα二聚体和αβ二聚体，所以检测CD8基因只需检测α链基因[3-4]。

在人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)研究过程中发现，CD4与CD8淋巴细胞在抵御HIV过程中发挥着重要作用，机体免疫系统正常时CD4淋巴细胞占60%左右，CD8淋巴细胞占40%左右，当发生病毒感染后，CD4淋巴细胞数量减少，CD8淋巴细胞数量相对增多，出现CD4与CD8淋巴细胞的比例失调，两者比例动态变化直接反应病毒感染机体的严重程度和病程进展，所以准确定量检测CD4与CD8淋巴细胞含量的动态变化是判断包括HIV等病毒性感染的关键指标[5]。因此，建立一种能准确定量检测CD4与CD8基因的方法对病毒性疾病检测非常必要。普通PCR和套式PCR只能定性检测目的基因存在与否，且由于PCR后还需要琼脂糖凝胶电泳等环节，操作繁琐耗时，人为操作因素还会导致结果不准确。目前，未见有关延边白鹅CD4和CD8淋巴细胞检测方法的报道。因此，本研究拟以延边白鹅CD4与CD8α(简称CD8)为目的基因，建立一种SYBR Green I荧光定量PCR方法，用于CD4与CD8转录水平的定量检测，该方法不但可以定量，而且操作简单、省时和廉价，不需要电泳环节，可以通过机器直接判读结果，将为CD4与CD8淋巴细胞的生物活性研究，以及延边白鹅发生病毒性感染后细胞免疫水平和病程发展提供一种行之有效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物与目的基因 延边白鹅由延边大学农学院生物技术动物饲养室饲养备用；延边白鹅CD4、CD8、IFN-γ和IL-2基因由延边大学农学院预防兽医实验室制备保存。

1.2 主要试剂 RT-PCR试剂盒、ExTaq酶、pMD19-T载体、DL2000 DNA Marker均购自TaKaRa公司；刀豆素A(ConA)购自Sigma公司；质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒购自Omega公司；SBYR GreenⅠPCR Master Mix购自美国Promega公司；鹅外周血单个核细胞分离液试剂盒购自天津澋洋生物制品科技有限责任公司；基因组RNA提取试剂盒购自康为试剂生物科技有限公司。

1.3 引物的合成与设计 根据延边白鹅CD4基因(KY034449)和CD8基因(KY034450)，以Oligo 6.0软件在基因保守区内设计两对特异性引物：CD4-F：5'-CAGGATCACCTCCTTTCCCTCAACC-3'/CD4-R：5'-GGAGTTGTGTGGTACAGCAGCAAGC-3'，CD8-F：5'-GGAGATGCCACTGTCTGCAGAACTC-3'/CD8-R：5'-GAGCCCAGAGCCAGAAGTACGTGAC-3'。引物由英潍捷基(上海)生物技术有限公司合成。

1.4 质粒标准品的制备 以延边白鹅CD4基因和CD8基因为模板，利用设计的引物克隆目的基因后进行TA克隆，利用胶回收试剂盒纯化回收目的片段，分别连接至pMD19-T质粒，构建pMD19-CD4，pMD19-CD8重组质粒。PCR反应条件：CD4：94℃3 min；94℃30 s；57.9℃30 s；72℃30 s；72℃10 min，30个循环。CD8：94℃3 min；94℃30 s；58.7℃30 s；72℃30 s；72℃10 min，30个循环。将质粒送英潍捷基(上海)生物技术有限公司测序，阳性质粒作为质粒标准品保存备用。

1.5 反应体系与反应条件的优化 在SYBR Green I荧光定量PCR反应总体积为20 μL不变的情况下，对引物浓度、模板、Reference Dye II和SYBR Premix ExTaqII酶等加入量进行矩阵优化；并对退火温度、反应循环数和反应时间等进行优化，最终确定最优反应条件。

1.6 标准曲线的建立 采用常规方法将1.4中两种质粒分别进行转化培养，选择菌液OD405nm值A260/A280在1.8～2.0之间的两个质粒标准品10倍倍比稀释(101～108)后分别作为模板，按照优化的条件进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，应用7500 software v2.0.6进行分析，并绘制标准曲线和溶解曲线。

1.7 特异性试验 应用已建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法，检测延边白鹅CD4、CD8、IFNγ和IL-2基因，同时设立延边白鹅CD4或CD8基因阳性对照和水阴性对照，评价该方法的特异性。

1.8 敏感性试验 以101～108共8个倍比稀释的质粒标准品作模板，按照优化后的条件进行荧光定量PCR反应，并同时进行常规PCR检测，对二者结果进行比较，分析该方法敏感性。常规PCR的引物、退火温度与本试验建立的荧光定量PCR方法一致。

1.9 重复性试验 选取103、104、105倍比稀释的质粒标准品为模板，按照优化的反应条件进行SYBR Green I荧光定量PCR，分别进行组内重复性试验，同时选择不同时间提取的质粒按照上述10倍倍比稀释后作为模板，进行组间重复性试验，计算各自变异系数并评估该方法的重复性。

1.10 鹅脾脏淋巴细胞的制备 无菌取鹅脾脏，用无钙镁离子PBS冲洗后，置于无菌9 cm平皿，将脾脏剪成碎沫，用60目细胞筛过滤，800 r/min离心8 min，利用RPMI1640细胞培养液重悬细胞后再洗2次，重悬后缓慢加入鹅外周血单个核细胞分离液液面上，1 000 r/min离心10 min，将乳白色细胞层吸出，置于24孔细胞培养板内培养。

1.11 鹅脾脏淋巴细胞中CD4与CD8的检测 鹅脾脏淋巴细胞孵育24 h后，分别加入60 μg/mL和120 μg/mL ConA继续培养24 h，并设立PBS对照，收集上清与细胞，利用RNA提取试剂盒提取总RNA，将其反转录成cDNA作为模板，按照已建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 阳性质粒标准品的制备 以本实验室前期获得的延边白鹅CD4基因和CD8基因为模板，利用设计的CD4-F/R和CD8-F/R引物PCR扩增目的基因，结果显示，克隆的部分CD4基因和CD8基因分别为121 bp和119 bp(图略)，将其进行TA克隆后测序，结果表明两个重组质粒标准品构建正确，分别命名为pMD19-CD4和pMD19-CD8，经检测和计算其浓度分别为1.2×109拷贝/μL和1.8×109拷贝/μL。

2.2 荧光定量PCR反应条件的优化 经反应条件优化，确定SYBR Green I荧光定量PCR方法的最终反应体系为SYBR Premix ExTaqII 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，ROX Reference Dye II 0.5 μL，cDNA模板3 μL，加DEPC处理水至25 μL。检测CD4基因和CD8基因的最优反应条件均为：95℃10 min后，95℃30 s，58℃1 min，40个循环；之后再95℃1 min，55℃30 s，95℃30 s。

2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立 将两个质粒标准品10倍倍比稀释(101～108)后，作为模板，并设立无菌水为阴性对照，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增。结果显示，标准曲线的相关系数均为0.999(图1)，具有较好的扩增效率，阴性对照无扩增。

图1 SYBR Green I荧光定量PCR检测CD4、CD8基因的标准曲线Fig.1 The standard curves of CD4,CD8 gene by SYBR Green I real-time PCR

2.4 荧光定量PCR溶解曲线的建立 对不同稀释度CD4和CD8质粒标准品进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，并进行溶解温度分析。结果显示，不同的CD4和CD8质粒标准品溶解温度分别为80.5℃和81.6℃，波峰与标准品浓度成正相关，且融解曲线均为单峰(图2)。表明两个基因的扩增产物均为单一产物。

2.5 特异性试验结果 经已建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法，检测延边白鹅CD4、CD8、IFNγ和IL-2基因，结果显示，仅延边白鹅CD4和CD8基因为阳性，而其它延边白鹅的细胞免疫因子基因均为阴性(图3)。表明本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法具有较强的特异性。

图2 SYBR Green I荧光定量PCR检测CD4和CD8基因的溶解曲线Fig.2 The dissolution curves of CD4 and CD8 genes by SYBR Green I fluorescence quantitative PCR

图3 SYBR Green I荧光定量PCR检测CD4和CD8基因的特异性试验Fig.3 Specificity analysis of the detection of CD4 and CD8 genes

2.6 敏感性试验结果 由CD4和CD8的SYBR Green I荧光定量PCR扩增图谱显示，质粒标准品均可被检测到的最小稀释倍数为108(图4)，较普通PCR检测浓度提高100倍(图5)，表明本试验建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法具有较高的敏感性。

图4 SYBR Green I荧光定量PCR检测CD4、CD8基因的扩增曲线Fig.4 The amplification curves of CD4,CD8 gene by SYBR Green I real-time PCR

图5 普通PCR检测CD4和CD8的敏感性试验Fig.5 Sensitivity of normal PCR to detect CD4 and CD8 gene

2.7 重复性试验结果 对不同稀释度的CD4和CD8标准品进行组内与组间重复性试验。结果显示，扩增CD4基因的荧光定量PCR方法组内变异系数为0.8%～1.1%，组间变异系数为1.3%～1.7%；CD8组内变异系数为0.7%～1.0%，组间变异系数为1.1%～1.3%(表1、表2)，变异系数均小于2%。表明所建立SYBR Green I荧光定量PCR方法具有良好的重复性。

表1 CD4荧光定量PCR的重复性试验Table 1 The repeatability assay of CD4 real-time PCR

表2 CD8荧光定量PCR的重复性试验Table 2 The repeatability assay of CD8 real-time PCR

2.8 鹅脾脏淋巴细胞CD4与CD8基因转录水平的检测结果 采用已建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法对ConA刺激鹅脾脏淋巴细胞24 h后CD4与CD8基因转录水平进行检测。结果显示，60 μg/mL和120 μg/mL的ConA刺激鹅脾脏细胞后，CD4与CD8基因转录水平均显著高于PBS对照组(p<0.05)，而两个剂量ConA刺激组之间差异不显著(p>0.05)。ConA可以激活鹅脾脏淋巴细胞CD4和CD8基因的转录水平。表明本实验建立的方法可以用于鹅CD4、CD8转录水平定量检测。

3 讨论

禽类与哺乳动物的T淋巴细胞均具有相同功能，可介导机体产生细胞免疫应答[6-7]。其中CD4与CD8分子在动物机体细胞免疫过程中发挥着重要做用，两者比例失衡反映机体免疫系统发生异常，或受到外源病原体侵入，检测CD4与CD8分子在机体内动态变化是评价某些传染病病程和病原体复制情况的重要指标。

在体外研究CD4与CD8分子需要借助能诱导免疫细胞分化的刺激原，ConA就是一种常用的有丝分裂原，其可以在体外刺激胸腺、脾脏等免疫细胞大量增殖，尤其对T淋巴细胞有激发作用，可以满足相关研究对免疫细胞的需要[8-10]。本研究未采用鹅胸腺细胞作为获得T淋巴细胞的组织源，因为雏鹅的胸腺过小，尝试多次仍满足不了T淋巴细胞的体外培养，而成年鹅胸腺出现萎缩，无法从成年鹅获取足够量胸腺组织进行后期SYBR Green I荧光定量PCR方法的应用试验。因此，本研究选取成年鹅的脾脏作为目的脏器，经剪碎和滤筛过滤后采用人淋巴细胞分离液Histopaque-1077分离鹅T淋巴细胞，所获得的淋巴细胞较少，没有达到试验要求，最终通过鹅外周血单个核细胞分离液试剂盒，获得了较好效果。通过Con A诱导，使培养的淋巴细胞CD4与CD8得到转录和表达，经本实验方法检测显示60 μg/mL和120 μg/mL的ConA诱导组之间CD4与CD8转录水平差异不显著(p>0.05)，提示在此剂量范围内，ConA剂量与CD4与CD8转录水平不存在明显的正相关性，表明本实验建立的方法可用于临床检测。

目前，用于基因定量检测的方法主要有染料荧光定量PCR和探针荧光定量PCR，探针荧光定量PCR方法虽然可以实现完全定量，但存在方法难建立、费用昂贵、操作要求高等缺点[11]。染料荧光定量PCR方法相对操作简单，所需费用较低，与探针相比唯一缺点是不能完全定量，只能相对定量，但完全满足检测CD4与CD8的动态比例要求[12]。在众多染料中，SYBR Green I是最常用、最稳定的一种染料，本研究采用SYBR Green I作为荧光染料，具有环保安全、荧光信号强和背景信号低等优点，在反应体系中加入了ROX reference Dye均一化参比染料，避免了反应体系内出现泡沫、蒸发和冷凝等导致不同批次间出现差异，建立方法特异性和敏感性良好，组间与组内变异系数均小于2%，具有很好的重复性，确保试验结果均一。

本研究建立了检测延边白鹅CD4与CD8基因的SYBR Green I荧光定量PCR方法，该方法快捷、简单，可以用于定量检测鹅CD4与CD8分子的转录水平和动态变化，为进一步研究鹅细胞免疫水平和CD4、CD8生物活性奠定了基础。