柳枝稷幼穗分化过程及其分期

赵晓晓， 谢坤良， 贾冬冬， 张舒梦， 孟 敏， 孙风丽， 张 超， 奚亚军

(西北农林科技大学农学院， 陕西 杨凌 712100)

柳枝稷(Panicumvirgatum)是多年生暖季型C4丛生草本植物，原产于北美，主要用于水土保持，或作为优良牧草和观赏植物。因其木质纤维素含量高、生物质产量大、生态适应性强，近年来成为国际上公认的能源模式作物而得到深入研究[1-3]，研究内容涉及生理学、遗传学、生态学等[4-8]多方面。柳枝稷在我国无论作为牧草、水土保持植物还是能源作物都具有广阔的种植前景[9-11]，但种子质量差与休眠等因素影响柳枝稷的成功建植[12]。幼穗分化过程的起始意味着植株从营养生长向生殖生长的转变，开始花芽的产生和结实器官的形成[13]，结实器官的特点直接影响到种子产量和品质等性状[14]，但关于柳枝稷幼穗分化的研究在国内外少见报道。另一方面，大幅度提高生物质产量是能源用柳枝稷品种选育的主要目标[15]，有研究发现营养生长期的延长与开花期的推迟使得柳枝稷表现出更高的生物量[16]，去除穗部可提高茎生物量分配比例进而柳枝稷生物量显著增加[17]。幼穗分化是营养生长与生殖生长的转折点，柳枝稷幼穗分化过程的探索对于柳枝稷的生长发育调控、栽培管理及品种选育都具有重要意义。柳枝稷属于禾本科，为圆锥花序，研究人员已经对多种禾本科草类的幼穗分化过程进行了观察与论述，包括糖蜜草(Melinisminutiflora)、早熟禾(Poapratensi)、高羊茅(Festucaarundinacea)等[18-20]花序类型与柳枝稷相同的禾草及多花黑麦草(Ldliummultiflorum)、披碱草(Elymusdahuricus)、狗牙根(Cynodondactylon)等[21-23]与柳枝稷花序类型不同的禾草，它们的幼穗分化特点及分化时期为柳枝稷幼穗分化规律的探索提供了参考。本研究观察了柳枝稷幼穗分化过程中的内部解剖特点及对应的外部形态特征并记录了植株的生长时期与物候期等，旨在为柳枝稷生殖生长特性与种子形成发育规律的揭示及其栽培管理调控提供科学依据。

1 材料与方法

供试材料为柳枝稷低地型品种“Alamo”，该材料种植在西北农林科技大学北校区试验田(108.06° E，34.29° N)，试验年度为生育期第三年。2018年5月22日观察到供试材料的第三伸长节可见，此后每隔2～3天取15个生长发育较一致的分蘖，记录叶龄、叶龄余数、可见叶数及幼穗长度等植株形态指标后于体视显微镜(OLYMPUS)下解剖，观察其生长锥发育情况并拍照；植株进入孕穗期后取花序不同部位单个小穗解剖观察；植株抽穗后选取特定分蘖挂牌，每天观察其开花规律，直至整个花序开花结束。幼穗分化时期的划分以幼穗上部分化状态为准。某期柳枝稷花序相对生长速率(Relative growth rate，RGR)的计算公式为：RGR= (L2- L1) /t，式中L2为某期结束时的花序长度，L1为某期开始时的长度，t为某期历时时间，数据使用Microsoft Excel 2013录入并作图。

2 结果与分析

2.1 幼穗分化过程

根据柳枝稷幼穗分化各阶段形态特点(如图1)，参考禾本科花序发育过程的分期标准[18-20,23-25]，将柳枝稷幼穗分化过程分为9个时期，各时期主要形态特点描述如下：

2.1.1苞原基分化期 营养生长锥不断分化叶原基，生长点呈半圆球形，被叶原基包裹覆盖(图1-A)。5月28日取材发现生长锥不再分化叶原基，顶部伸长，略高于最后一片叶原基，(图1-B)剥开叶原基可见生长锥基部出现一圈突起即第一苞原基(图1-1a)。第一苞原基的出现标志着花序分化的开始。随着生长锥不断伸长继而分化出第二苞、第三苞……整个生长锥呈圆柱形，可见层层环状突起(图1-1b)。

2.1.2枝梗原基分化期 苞原基腋部向外突出形成1次枝梗原基并逐渐从下到上分化直至生长锥的顶部，生长锥不断伸长，1次枝梗原基的数目不断增多(图1-2a)；在1次枝梗原基分化后期，生长锥基部的1次枝梗原基基部又产生半球状突起即2次枝梗原基，仍然从下到上分化(图1-2b)；当生长锥上部分化出2次枝梗原基时，其基部的2次枝梗原基再次产生突起渐次向上分化，即3次枝梗原基。整个幼穗花序呈锥体由许多突起组成，将生长锥顶部环在中央(图1-2c)。

2.1.3小穗分化期 花序顶部枝梗发育较快，不久便分化出小穗原基，随后渐次向下分化，单个枝梗上则是从基部开始依次向上分化。随着小穗原基不断增长，花序顶部率先分化出的小穗原基基部很快便会分化出颖片原基，包括外颖原基和内颖原基。小穗排列紧密，花序呈明显穗状(图1-3a,3b)。

2.1.4小花原基分化期 首先在内颖原基上部分化出第一小花即不育花的外稃原基及其小花原基，尔后在第一小花的小花原基上方分化出第二小花即可育花的外稃原基及其小花原基，内稃尚未开始分化。外颖生长速度较快，长出刺芒并高于小花原基，小穗梗开始伸长(图l-4a,4b)。

从整个幼穗花序来看，顶端的小穗较早分化出小花原基，然后向下依次分化；在单个枝梗上，依然是最顶端小穗最早分化出小花原基，尔后渐次向下分化，发育顺序与分化顺序相同。

2.1.5雌雄蕊原基分化期 当外颖在小花顶部逐渐闭合时，可育花的小花原基表面形成3个半球状突起即雄蕊原基，其包围着中央的雌蕊原基，可育花雌雄蕊的发育早于不育花并始终领先不育花雌雄蕊的发育。雌雄蕊原基直径不断增大呈圆球形，内颖开始伸长，其顶端同样具有刺芒，小穗、小穗梗及枝梗的长度显著增加(图1-5a-5c)。

2.1.6药隔形成期 雄蕊横向增长，由圆球形变得宽扁，顶部向下纵裂似一条“浅沟”将其一分为二。内颖与外颖继续伸长，外颖可见明显中脉(图1-6a-6c)。

2.1.7花药四分期 雄蕊顶部呈“十”字样再次纵向裂变，花药雏形可见。外稃开始伸长，其对侧产生内稃原基，不育花内外稃发育早于可育花(图1-7a-7c)。

2.1.8花药伸长期 第一阶段，花药纵向伸长呈四棱柱状，雌蕊顶部凹陷产生两个突起，内稃开始伸长，内颖长度逐渐超过外颖，顶端刺芒由白色变为紫色(图1-8a-8c)；第二阶段，可育花花药颜色由半透明变为黄绿色，不育花花药仍呈半透明，雌蕊二叉状柱头形成，此时浆片明显可见呈半透明且多汁，不育花雌蕊退化，内外颖边缘由绿色变为紫色(图1-8d-8f)；第三阶段，花药与柱头显著伸长，可育花花药长度约为其宽度的3倍以上，花药颜色再次发生改变，可育花花药鹅黄色，不育花花药黄绿色，内外稃未完全闭合，内外颖着色加深，小穗长度达到最大(图1-8g-8i)。植株处于抽穗期，枝梗排列紧密，花序呈穗状(图1-C)。

2.1.9羽状柱头形成期 第一阶段，雌蕊二叉状柱头端部产生颗粒状突起，子房增大，两个花柱间距明显，可育花花药由鹅黄色变为金黄色，不育花花药由黄绿色变为鹅黄色(图1-9a-9c)；第二阶段，柱头上的突起逐渐伸长为细毛，毛间粘连、紧凑，不育花与可育花花药均呈金黄色(图1-9d-9f)；第三阶段，柱头上的细毛进一步伸长，均匀、松散分布，白色羽状柱头成形，花柱弯曲，可育花花药约为不育花花药的1.3-1.5倍。浆片白色、革质化，内外稃逐渐闭合，小穗明显增粗(图1-9g-9i)。花序枝梗由密集紧凑变得松散，依次向外螺旋展开，呈圆锥形(图1-C)。分化完全的小穗与小花的结构组成如图1-D所示。

随后雌雄蕊逐渐发育成熟，羽状柱头的篷松细毛由白色变为紫色，不育花花药与可育花花药近等长，花药、子房增大使得内外颖不再闭合，植株进入开花期，可育花先于不育花开花，其内外稃张开，花丝将花药顶出颖壳以散粉，柱头向两侧伸展接受花粉(图1-a-e)。

图1 柳枝稷幼穗分化过程Fig.1 The spike differentiation progress in switchgrass注：A营养生长锥；B生殖生长锥；1a苞原基分化期；1b苞原基继续分化过程；2a一次枝梗原基分化期；2b二次枝梗原基分化期；2c三次枝梗原基分化期；3a小穗分化期；3b幼穗局部放大可见小穗原基；4a-4b小花原基分化期的幼穗及幼穗局部放大可见小花原基；5a-5c雌雄蕊原基分化期的花序、小穗及小穗解剖后可见雌雄蕊原基突起；6a-6c药隔形成期植株顶部、小穗及雄蕊的形态；7a-7c花药四分期植株顶部、小穗及雄蕊的形态；8a-8c花药伸长期第一阶段的小穗、雄蕊及雌蕊；8d-8f花药伸长期第二阶段的小穗、雄蕊及雌蕊；8g-8i花药伸长期第三阶段的小穗、雄蕊及雌蕊；9a-9c羽状柱头形成期第一阶段的小穗、雄蕊及雌蕊；9d-9f羽状柱头形成期第二阶段的小穗、雄蕊及雌蕊；9g-9i羽状柱头形成期第三阶段的小穗、雄蕊及雌蕊；C抽穗期花序形态的变化；D柳枝稷小穗的结构；a-b开花期的雌蕊与雄蕊；c枝梗最顶端小穗可育花开花；d单个小穗中可育花先开花，不育花内外稃仍闭合；e枝梗最顶端小穗不育花与下位小穗可育花开花Note:A Nutrient growth cone;B Reproductive growth cone;1a Differentiation stage of bract primordia;1b Continued differentiation stage of bract primordia;2a Differentiation stage of primary branch primordia;2b Differentiation stage of secondary branch primordia;2c Differentiation stage third branch primordia;3a Differentiation stage of spikelet;3b Spikelet primordia (local enlargement);4a-4b The spike and its local enlargement in differentiation stage of floret primordia;5a-5c Differentiation stage of stamen and pistil primordia;6a-6c Stamen connective formation stage;7a-7c Anther quarters stage;8a-8c The first subphase of anther elongation;8d-8f The second subphase of anther elongation;8g-8i The third subphase of anther elongation;9a-9c The first subphase of feathery stigma formation;9d-9f The second subphase of feathery stigma formation;9g-9i The third subphase of feathery stigma formation;C Changes of inflorescence during heading stage;D Spikelet structure of switchgrass；a-b Mature stamen and pistil in blooming stage;d-e Flowering sequence

综上所述，柳枝稷幼穗分化过程的主要分期特征及分化时间见表1：本研究发现小花原基分化期及其之前各分化期持续时间为10天，雌雄蕊原基分化期至花药四分期的每个时期只需6天即可完成分化，花药伸长期与羽状柱头形成期所需分化时间均为12天，可见柳枝稷幼穗分化过程是一个先慢后快又逐渐变慢的过程，柳枝稷幼穗分化起始至开花约需3个月。

表1 柳枝稷幼穗分化过程的分期及各期主要特征Table 1 Spike differentiation stages and their major characteristics in switchgrass

本研究记录了柳枝稷幼穗分化各时期的花序长度等植株形态指标，为了更好地阐明植株的生长状态，我们参照多年生牧草生长时期的划分[26]标明了柳枝稷幼穗发育各时期所处的生长时期(En:Elongation-Stem elongation，伸长阶段茎发育状态；Rn:Reproductive-Floral development，繁殖阶段花序发育状态)，同时也划定了物候期，以期从大田植株的外观形态大致判断柳枝稷幼穗分化进程。由表2可发现柳枝稷雌雄蕊原基分化期之前的发育在拔节期完成，植株从E4节伸长至E6节，叶龄、叶龄余数及可见叶数变化明显，但幼穗生长速度较慢，长度不足5 mm；从雌雄蕊原基分化期开始，植株进入孕穗期，花序长度迅速增加，小穗也逐渐增大，叶龄在花药四分期达最大值，此时植株开始抽穗，花序继续伸长生长，R0至R2阶段伴随着E7、E8的伸长。所以，柳枝稷幼穗分化前期叶龄、叶龄余数及可见叶数能在一定程度上反应幼穗分化进程，柳枝稷幼穗分化中后期主要是花序及小穗的长度(表2)与形态(图1-8,9,C)可辅助判断幼穗分化所处时期。

表2 柳枝稷幼穗分化各时期对应的植株形态Table 2 Corresponding plant morphology of spike differentiation stage in switchgrass

注：叶龄：以展开叶的数目计，展开叶以叶片与叶鞘交界处的叶枕露出为准；可见叶数：植株已经长出并能够看见的叶片数目

Note:Leaf age:The number of unfurled leaves whose collar were visible;Visible leaves number:The number of visible leaves that the plant had grown

为了衡量柳枝稷花序在幼穗分化各期的生长速率变化，我们以柳枝稷幼穗分化时期为横坐标，以柳枝稷花序的相对生长速率为纵坐标，得到如图2所示的花序生长曲线，可发现柳枝稷花序在分化初期即苞原基分化期至小花原基分化期生长较慢，而在雌雄蕊原基形成期花序相对生长速率迅速增大并在整个孕穗期保持稳定，随后在花药伸长期相对生长速率达到最大值，在羽状柱头形成期又逐渐变小，所以柳枝稷的花序呈慢-快-慢的“S”形曲线生长。

图2 柳枝稷幼穗分化过程中花序相对生长速率的变化Fig.2 Changes in relative growth rate of the inflorescence during the spike differentiation progress in switchgrass

2.2 小花开花习性

从整个花序来看，顶端小花即直接着生在花梗上的小花先开花，再渐次向下开放，上位枝梗开花早于下位枝梗，但上位枝梗小花开花后下位枝梗随即开花，邻近的各1次枝梗之间其开花时间是重叠的；在单个1次枝梗上，1次枝梗上位小花先开花，随后1次枝梗下位小花与各2次枝梗上位小花开花，接着各2次枝梗下位小花与3次枝梗上位小花也依次向下开放，但下位枝梗上位小花早于上位枝梗下位小花的开放，3次枝梗上的下位小花最晚开花，说明单个小枝梗上，小花仍然是从上到下依次开花；对于每个小穗来说，依然是上部可育花先于基部不育花开花。开花期中下部各次枝梗上均有小花退化干枯的现象。

3 讨论与结论

3.1 柳枝稷幼穗分化时期的划分及鉴定

许多学者对禾本科粮食作物、牧草及草坪草的幼穗分化过程进行了研究，只是划分的标准不一：付娟等[24]依据生长锥外部形态特点以及枝梗和小穗的细胞学形态特点将水稻(Oryzasativa)幼穗分化过程分为4个时期；王俊英等[25]依据小麦(Triticumaestiuum)小花发育过程的内部解剖结构和对应的穗部性状与外部形态如始伸节间等，将小麦小花分化过程分为8个时期；李煜祥等[18]依据幼穗发育程度将糖蜜草幼穗分化过程分为9个时期并记录了与之对应的幼穗长度和叶龄余数；刘露等[19-20]将高羊茅和草地早熟禾的幼穗分化过程分为5个时期并对其开花习性和发育各阶段所处的物候期进行了详细观察；程晓丽等[23]通过对茎尖发育动态的观察，将狗牙根花序分化过程分为8个时期并记录了各时期取样时生殖枝上展开的叶片数。柳枝稷与同为圆锥花序的水稻、糖蜜草、高羊茅及草地早熟禾幼穗分化过程相似，但水稻与糖蜜草分化时期的划分既有幼穗外观形态又有细胞学层次；高羊茅与草地早熟禾的雌雄蕊形成期概括了雌雄蕊原基开始分化到最后成熟；而小麦与狗牙根虽然与柳枝稷花序类型不同，但对小花分化期及以后的发育阶段有着较为详细的叙述。综合以上禾本科物种的幼穗形态描述及柳枝稷幼穗发育的形态特点，本研究将柳枝稷幼穗分化过程分为9个时期：苞原基分化期、枝梗原基分化期、小穗分化期、小花原基分化期、雌雄蕊原基分化期、药隔形成期、花药四分期、花药伸长期、羽状柱头形成期。

幼穗发育初期体积较小，肉眼难以观测，必须借助解剖镜与显微镜辨别，这在生产实践上难以广泛应用，我们可以借助生殖器官与营养器官发育的相关性及发育阶段所处的物候期来辅助判断幼穗分化时期[13,22]。宫玉麟[27]以叶龄指数鉴定大麦幼穗分化进程；王俊英等[25]则记录了与小麦小花分化过程对应的穗长、叶龄余数、始伸节间及生育期等外部形态特征；谢菲等[22]研究了披碱草幼穗分化与物候期、幼穗长度、株高等植株形态的关系。在本实验中，柳枝稷幼穗分化前期，植株处于拔节期(包括苞原基分化期至小花原基分化期计4个时期)与孕穗期(包括雌雄蕊原基分化期与药隔形成期)，叶龄、叶龄余数及可见叶数随幼穗分化过程的进行变化显著，因而可作为柳枝稷幼穗分化进程的辨别依据，在植株达到最大叶龄时(花药四分期)植株开始抽穗，我们便可从花序与小穗的长度及形态来判别柳枝稷幼穗分化进程(花药伸长期至羽状柱头形成期计2个时期)。

3.2 柳枝稷幼穗分化的特点

柳枝稷幼穗分化是一个先慢后快又变慢的过程，同花序的相对生长速率变化趋势相同，可见柳枝稷花序的分化与生长规律一致。柳枝稷幼穗分化起始于E4拔节期，而高羊茅[20]与草地早熟禾[19]起始于返青期，但三个物种的小穗分化期与颖花原基分化期都在拔节期完成且都是从雌雄蕊原基分化期开始进入孕穗期，所以三者的幼穗分化规律是相似的。柳枝稷小花的分化、发育及开花顺序，无论花序整体还是单个枝梗，都是从上向下依次进行的，这与糖蜜草、早熟禾及高羊茅[18-20]等有所不同，糖蜜草等花序顶端枝梗上的小穗先分化出小花原基，然后逐步向下，单一枝梗上，小花原基却从下而上分化，但最顶端小穗上的小花原基先发育，然后从下向上发育，即顶端数第二小花发育最晚，且它们的开花顺序与其小花发育顺序一致。另外，柳枝稷每个小穗仅含两朵小花，即第一小花不育花与第二小花可育花，同糖蜜草小花分化规律一致，但早熟禾与高羊茅是有多朵小花分化的。糖蜜草等的花期约1周，而柳枝稷花序较大，花期可达3～4周，且花序不同部位分化发育程度差距较大，当花序顶部开花时，其基部枝梗上小穗的小花刚进入花药伸长期，因而在本研究中柳枝稷幼穗分化各期的划分标准以花序上部分化状态为准。