略阳乌鸡 METTL21C基因克隆及超表达载体构建

路宏朝，李蕊清，孙志阳，王 令，张 涛

(陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西汉中 723000)

甲基转移酶样21C(Methyltransferase like 21C,METTL21C)是一种类甲基转移酶，属于甲基转移酶样21 (Methyltransferase like 21，METTL21)亚家族中的一员，该亚家族共有4个 成员，包括METTL21A、METTL21B、METTL21C和METTL21D[1-4]。甲基转移酶主要参与蛋白质翻译后的甲基化修饰过程，影响蛋白质的结构和功能，进一步调控信号分子与目标蛋白之间的相互作用，从而参与DNA修复、蛋白质相互作用和细胞增殖分化等重要生命过程[5-6]。研究发现，METTL21亚家族成员可通过与分子伴侣结合发挥生物学功能[7]。其中，METTL21D与分子伴侣含缬酪肽蛋白(Valosin-containing protein,VCP)结合，调节VCP的翻译后修饰。当METTL21D表达失调后，将导致神经肌肉疾病发生[8]。METTL21C具有蛋白-赖氨酸N端甲基转移酶活性，在脊椎动物所有组织中均表达，尤其在骨骼肌中高表达[9]。Tizioto等[10]采用QTL(Quantitative trait loci)分析Nellore牛品质时发现，高品质牛肉中METTL21C表达较高。Huang等[11]采用GWAS(Genome-wide association study)分析发现METTL21C基因突变与人类肌肉减少症有关，进一步在C2C12鼠成肌细胞中验证其功能，发现METTL21C通过调节钙浓度的平衡而促进成肌细胞分化，抑制肌肉萎缩。由此可知，METTL21C可能参与哺乳动物骨骼肌生长发育过程。但关于鸡源METTL21C基因研究鲜见报道。鉴于此，本试验以略阳乌鸡为材料，提取略阳乌鸡腿肌组织总RNA，以反转的cDNA为模板，克隆METTL21C基因的CDS区序列，分析其生物信息学特征；将METTL21C片段克隆至pMD19-T载体，并插入真核超表达载体，分析其表达情况，为METTL21C基因后续的生物学功能研究提供技术支持，并为家鸡骨骼肌生长发育机制研究提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 略阳乌鸡受精蛋购自略阳县同辉乌鸡养殖场，于科裕全自动孵化机中孵化获得初生6 d略阳乌鸡。

1.1.2 主要试剂及仪器 限制性内切酶、PrimeScript反转录试剂盒、SYBR Premix E×TaqTMⅡ试剂和ECL(Electro-Chemi-Luminescence)曝光液由TaKaRa公司提供；T4DNA连接酶购自New England Biolabs公司；含φ=10% FBS(Fetal bovine serum)的高糖DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培养基(Gibco)；Lipofectamine 2000(Invitrogen)； FLAG抗体购自Cell Signaling Technology公司；细胞总蛋白提取试剂盒(HEART)；HRP标记的二抗(康为世纪，1∶1 000)；GeneGnome XRQ化学发光系统(Synoptics, USA)；倒置荧光相差显微镜(Leica，DFC450, USA)；实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 方 法

1.2.1METTL21C基因组织差异表达 分别取初生6 d的略阳乌鸡胃、砂囊、肺脏、骨骼肌、肝脏、皮肤和心脏7种组织，采用Trizol法分别提取总RNA，核酸/蛋白测定仪测其浓度[12]。分别以不同组织总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，按照PrimeScript(TaKaRa)反转录试剂盒，进行反转录反应，合成相应的cDNA。分别以7种组织的cDNA为模板，选取鸡的β-actin作为内参基因。采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测METTL21C基因的mRNA表达水平(引物序列见表1)。扩增体系：SYBRⅡ (TaKaRa) 10 μL，Primer F/R 3.2 μL，cDNA2 μL，H2O 4.8 μL。反应程序：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min。溶解曲线收集信号的程序：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s 。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 引物设计与合成 根据GenBank公布的鸡METTL21C基因序列，采用Primer 5.0设计针对鸡METTL21C基因的特异性引物，并分别在上下游引物中加BamHI和EcoRI限制性内切酶位点。引物序列为：上游引物CCGGAATTCCCCAACAAAATGCAAAG，下游引物CGCGGATCCAGTTCTCTCTTACCGTGGCTT，引物由北京奥科生物科技有限公司合成。

1.2.3 总RNA提取及cDNA的合成 采用Trizol法提取略阳乌鸡腿肌组织总RNA，测定浓度[12]。以提取总RNA为模板，Oligo(dT)为引物, 采用PrimeScript反转录试剂盒，进行逆转录反应，合成cDNA。

1.2.4METTL21C基因片段克隆 以略阳乌鸡腿肌组织cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：10× PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，cDNA模板 2 μL，上下游引物各1 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，ddH2O 36 μL。PCR反应程序为Touch Down。PCR反应结束后，取适量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并于凝胶成像系统中成像、分析。

采用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳分离、切胶，根据胶回收试剂盒回收基因片段。将目的片段与载体pMD19-T于16 ℃过夜连接。16 ℃过夜连接后转化至DH5α感受态细胞，于37 ℃ 培养。

1.2.5 菌落PCR检测及测序 将“1.2.4”中感受态细胞于37 ℃培养12～16 h后，从平板上挑取5个单菌落于20 μL灭菌的ddH2O中，震荡充分混匀。取上述1 μL菌液进行菌落PCR检测，反应体系(20 μL)：Mix 10 μL，模板1 μL，上下游引物各加1 μL，ddH2O 7 μL，反应程序同“1.2.4”所述。PCR鉴定后，将含有目的片段的菌液送至通用生物系统(安徽)有限公司进行序列测定。

1.2.6 生物信息学分析 利用NCBI的ORF Finder对METTL21C基因进行开放读码框分析；利用NCBI BLAST 对METTL21C基因序列进行同源性分析；采用Mega 5.0软件构建METTL21C系统进化树[13]。

1.2.7 真核超表达载体的构建 从pMD19-T- METTL21C质粒上采用BamHI和EcoRI进行双酶切后回收METTL21C基因片段，同时用BamHI和EcoRI双酶切带有Flag标签的pCD513B空载体，进行连接并转化至DH5α感受态细胞，取适量感受态细胞均匀涂布于含氨苄的LB平板，于37 ℃培养。挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，筛选阳性克隆，抽提质粒，进行酶切验证。

1.2.8 重组质粒表达分析 在已构建的Flag-pCD513B-METTL21C重组载体转染至293T细胞中，空载体pCD513B作为对照组。用opti-MEM分别稀释质粒和Lipofectamine 2000 转染试剂，静置5 min后，混合质粒稀释液和转染试剂，静置20 min，加入细胞培养皿，37 ℃、φ=5% CO2培养。培养48 h后在倒置荧光显微镜下观察荧光，并通过Western Blot检测其表达水平。

2 结果与分析

2.1 略阳乌鸡不同组织中 METTL21C基因的表达水平

选取鸡的β-actin为内参基因，采用qPCR技术检测METTL21C在胃、砂囊、肺脏、骨骼肌、肝脏、皮肤和心脏7种组织中的表达水平。结果显示，以胃组织中的表达水平为对照，METTL21C在心肌组织中表达量最高，其次是骨骼肌，皮肤中表达量略高于胃组织中，砂囊和肺组织中的表达量低于胃组织，但差异不显著(图1)。

*表示差异显著(P<0.05) * mean significant difference(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01) ** mean exemely significant difference(P<0.01)

图1鸡METTL21C基因在7种组织中mRNA的表达
Fig.1mRNAexpressionlevelofMETTL21Cinseventissuesfromchicken

2.2 METTL21C基因片段克隆

以略阳乌鸡腿肌组织cDNA为模板，进行PCR扩增，经20 g/L琼脂糖凝胶检测，发现3号泳道出现与768 bp大小一致的条带(图2)。回收METTL21C片段与载体pMD19-T连接，转化后，挑取5个单菌落，进行菌落PCR检测，发现 3个阳性克隆(图3)。挑选阳性克隆菌液经通用生物系统(安徽)有限公司测序验证，结果表明成功克隆获得METTL21C基因的CDS区序列。

2.3 METTL21C基因CDS区核苷酸序列及编码氨基酸序列分析

应用NCBI的ORF Finder程序分析METTL21C基因序列， 发现METTL21C基因CDS区全长序列为747 bp，软件分析其碱基组成，A：31.3%，T：25.5%，G： 21.0%，C： 22.2%，共编码249个氨基酸(图4)。

M.DNA标准 DNA marker (DL2000) ; 1～3.PCR扩增产物 PCR amplification product

图2片段METTL21C的PCR扩增
Fig.2PCRamplificationofMETTL21Cgene

M.DNA标准 DNA marker ( DL2000) ; +.阳性克隆 Positive clones；-.阴性克隆 Negative clones

图3菌落PCR鉴定
Fig.3IdentificationofcolonyPCR

2.4 略阳乌鸡 METTL21C基因进化树构建

将获得的略阳乌鸡METTL21C基因序列与原鸡及其他物种的METTL21C基因进行比对分析，并以牛的基因序列为根，通过Mega 5.0软件中的Neighbor-Joining Tree 法构建略阳乌鸡METTL21C基因的系统进化树(图5)。由图5可知，在METTL21C基因位点，本研究所选择的物种形成两大支系包括中国家鹅、阿德里企鹅等，另一个支系以原鸡为代表，略阳乌鸡与原鸡序列同源性最高，其次是鹌鹑、火鸡和珍珠鸡。

图4 略阳乌鸡 METTL21C基因CDS区序列及编码蛋白序列Fig.4 CDS region sequence and deduced amino acid of METTL21C gene in Lueyang black-bone chicken

图5 METTL21C进化树分析Fig.5 METTL21C evolutionary tree analysis

2.5 METTL21C真核超表达载体构建

经BamHI和EcoRI双酶切后回收METTL21C目的片段和带有Flag标签的空载体，连接转化后进行菌落PCR鉴定和酶切验证，发现4个单菌落均得到与METTL21C基因(768 bp)大小一致的片段(图6)，选取其中一个阳性克隆扩增抽提质粒，进一步用BamHI和EcoRI双酶切进行验证。结果发现， pCD513B- METTL21C重组质粒被BamHI和EcoRI切开，所克隆的METTL21C基因成功插入pCD513B空载体(图7)，说明pCD513B- METTL21C超表达载体构建成功。

M.DNA标准 DNA marker(DL2000); 1-4.4个单菌落PCR产物 PCR product four single colonies

图6菌落PCR鉴定
Fig.6IdentificationofcolonyPCR

M.DNA标准 DNA marker (DL2000) ；1.未切质粒 Undigested plasmids；2.双酶切产物 Enzyme-digested products

图7pCD513B-METTL21C酶切验证
Fig.7Enzyme-digestedproductsofplasmids

2.6 METTL21C超表达载体表达研究

将pCD513B- METTL21C含Flag标签的重组载体转染至293T细胞，48 h后倒置荧光显微镜下观察，发现细胞内出现大量绿色荧光，表明质粒成功转入细胞中(图8)；采用Western Blot检测转染后METTL21C蛋白表达情况。结果发现，超表达组在30 ku大小处出现蛋白条带(图9)，与目的蛋白大小一致。

A. 白光 White; b. 绿光 (200×) Green (200×)

图8转染METTL21C重组质粒荧光观察
Fig.8Fluorescenceobservationaftertransfecting

图9 METTL21C蛋白表达水平Fig.9 Expression of METTL21C protein level

3 讨 论

作为蛋白质甲基转移酶，METTL21C可能通过甲基化修饰作用抑制或激活蛋白质活性[14-15]。在肌肉生长发育过程中，蛋白质甲基化修饰效应普遍存在。例如，内源性甲基转移酶G9(Aeuchromatic histonelysine N-methyltransferase 2, EHMT2)通过影响成肌分化决定因子(Myogenic differentiation antigen，MyoD)和肌细胞增强因子(Myocyte enhancer factor 2,MEF2，MEF2D)的甲基化水平而调控肌细胞分化[16-17]。而对于METTL21C基因的研究报道主要集中于人和小鼠，大部分文献侧重于蛋白结构方面研究[18]，关于METTL21C在鸡骨骼肌发育中的作用及机制尚不清楚。因此，为进一步阐明METTL21C基因在骨骼肌发育中的作用，本试验利用qPCR技术检测其在略阳乌鸡各组织中的表达情况，获得其组织表达谱。结果显示，METTL21C在略阳乌鸡胃、砂囊、肺脏、骨骼肌、肝脏、皮肤和心脏7种组织中均有表达，其中心肌中表达量最高，其次是骨骼肌，与大部分文献报道一致[9-10]。在肌肉组织中的高表达可能预示着METTL21C基因在肌肉生长发育过程发挥着重要的生物学功能，但关于该基因功能鉴定及其作用机制还有待进一步试验研究。

本研究采用基因克隆和核酸测序技术获得鸡METTL21C基因的CDS区核苷酸序列，分析发现其CDS区核苷酸序列长度为747 bp，共编码249个氨基酸。氨基酸序列相似性比对分析发现，略阳乌鸡METTL21C基因与原鸡具有较高的同源性，同时通过构建进化树也显示出该基因序列在禽类动物中高度保守，说明METTL21C基因不能用于畜禽品种之间的分类鉴定，但是可用于鸟类及其他物种属、种级的分类鉴定和系统进化分析。结合GeneBank数据库、文献报道及本试验结果发现，METTL21C基因在不同物种均存在，且序列的相似度较高，说明该基因是一个较为古老的基因，对机体的生长发育具有重要意义。另外，本试验构建鸡METTL21C基因超表达载体并在细胞水平成功表达，可为进一步解析METTL21C基因在家鸡骨骼肌生长发育机制奠定基础。