火炭母总黄酮局部给药治疗细菌性阴道炎的可行性*

，，，，，，

(1.漳州卫生职业学院，福建漳州 363000；2.漳州卫生职业学院医检所；3.厦门大学附属第一医院中心实验室)

火炭母也叫赤地利，为蓼科(polygonaceae)蓼属(polygonum)植物火炭母(polygonum chinense L.)的干燥全草。《实用中草药》中记载赤地利的适应症除了痢疾、肠炎、肝炎等还有白带[1]，而在《中草药手册》中同样记载了赤地利具有治疗妇女白浊、白带的用法[2]。在漳州民间，有一些老中医也会用赤地利水煎液治疗妇女带下症。据统计，细菌性阴道炎易发于生育期妇女，在非妊娠妇女中占15%～33%，在妊娠妇女中占16%～29%。此外，临床发现的各种阴道炎常为混合性感染，其感染率可高达64.4%，病后均有白带增多、外阴疹痒、阴道灼痛等症状，给妇女的身心健康和工作学习带来了严重的影响[3-4]。天然产物因其化学多样性成为抗生素替代物的主要来源，而且逐渐成为一些细菌性疾病的重要治疗药物[5]。火炭母主要化学成分以黄酮类和有机酚酸类为主[6]，具有很好的抗菌抗炎作用[7-8]，而且局部给药可以减少肝脏首过效应提高药效[9]，因此评价火炭母总黄酮局部治疗效果有助于寻找抗生素替代物及可行的给药途径。

1 材料与方法

1.1供试菌种及动物 菌种：金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、大肠杆菌(escherichia coli)、铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)。动物：清洁级ICR雌性小鼠，购自福建医科大学动物实验中心，SCXK(闽)2016-0002。

1.2仪器及试剂 仪器：立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅)，恒温震荡培养箱(上海知楚， ZHLY-180)，超净工作台(苏净，SW-CJ-2FD)，紫外分光光度计(北京普析，T6)，高速台式冷冻离心机(长沙湘仪，TGL-16M)，镊子，1.5 mL离心管，锥形瓶，10 mL小烧杯，酒精灯，移液枪(Thermo，美国)，一次性注射器，小鼠灌胃器，弯头小镊子，酶标仪(Rayto 6100 T，美国)，电子天平(上海精科，FA 2004)，病理切片 (RM2245，Leica，日本)，包埋机(HistoCore Arcadia C，Leica，日本)，全自动脱水机(湖北徕克医疗仪器有限公司)，光学倒置显微镜(DM750，Leica，日本)。试剂：火炭母总黄酮溶液(本实验室制备)，无菌生理盐水(本实验室制备)，PBS缓冲液(NaCl 8 g， KCl 0.2 g， Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，调pH 7.4)，甲醛(40 %，西陇化工)，EDTA钠盐(西陇化工，AR)，CRP检测试剂盒(小鼠Elisa，上海博士德)，PCT检测试剂盒(上海博士德，小鼠Elisa)，IL-6检测试剂盒(上海欣博盛科技有限公司，小鼠Elisa)，IL-10检测试剂盒(欣博盛，小鼠Elisa)，普通化学试剂均购自广东汕头西陇化工厂。

1.3供试培养基 血平板(广东环凯微生物科技有限公司)，LB肉汤培养基(北京陆桥技术有限公司)。

1.4火炭母总黄酮对细菌性阴道炎的抗炎作用

1.4.1最小杀菌浓度(MBC)测定 将获得火炭母总黄酮按照事先设计的加样方法，使24孔板中每种菌的黄酮测试浓度为10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL，将菌悬液100 μL接种于各浓度梯度孔中，接种后置37 ℃震荡培养箱中培养，转速为120 r/min培养24 h，分别吸取液体培养物0.1 mL，移种在不含药物的LB营养琼脂培养基上，经孵育过夜，分别计数菌落，其菌落数<5个的药物浓度即为MBC。实验设3个平行重复。

1.4.2小鼠造模 参照文献[10]方法，取32只雌性小鼠分为空白对照组、阳性对照左氧氟沙星组、阴性对照模型组，火炭母总黄酮处理组，每组小鼠8只。其中，对阳性对照组、阴性对照组、火炭母总黄酮组进行细菌性阴道炎造模，每天给予小鼠阴道注射由大肠杆菌、金葡菌、铜绿假单胞菌按1∶1∶1配制成的混合菌悬液0.3 mL，直至小鼠阴道口可见明显红肿和脓状物流出，建模时间为7 d。建模成功后，给予阴道注射给药，给药时将小鼠灌胃器折弯成一定弧度，采用一次性针筒连接小鼠灌胃器每天给小鼠阴道注射，连续给药7 d。空白对照组和阴性对照组不给药，阳性对照组根据药品用药指导转换成小鼠用药量，每天阴道局部给药0.5 mg/mL左氧氟沙星溶液0.2 mL/d，火炭母总黄酮处理组按最小杀菌浓度的火炭母总黄酮给药0.2 mL/d。

1.4.3血液采集及炎症因子检测 对小鼠眼眶静脉取血，收集血液于EP管中，取部分血液于事先加入抗凝剂EDTA钠盐溶液的EP管中做白细胞计数[11]，其余室温静置2 h离心，取上层血清，在450 nm处用Elisa法检验小鼠血清中的降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)。

1.4.4小鼠阴道病理切片制作及观察 将取完眼眶静脉血的小鼠迅速解剖，取其阴道及宫颈组织，用生理盐水冲洗表面血液后用滤纸轻轻吸去水分后，迅速将其用事先配制好的10 %甲醛固定14 h，取出后冲洗去除表面杂物，进行病理切片，在显微镜底下观察组织变化。

2 结果

2.1火炭母总黄酮最小杀菌浓度(MBC)测定 在24孔板中，除了对照组之外，加入总黄酮后培养过夜。10 mg/mL及5 mg/mL的孔底有菌体沉淀，上层较澄清，其他孔中培养液浑浊，平板孵育后，仅10 mg/mL总黄酮处理后的培养液孵育结果为0，确定其最小杀菌浓度10 mg/mL，给药处理中以此浓度局部给药。见图1，见表1。

图1 火炭母总黄酮抑菌结果

菌种1052.51.250.6250.313对照大肠杆菌澄清度++++++++++++++单菌落0条带条带条带条带条带条带金葡球菌澄清度++++++++++++++单菌落0条带条带条带条带条带条带铜绿杆菌澄清度++++++++++++++++单菌落0条带条带条带条带条带条带

注：“ - ”表示澄清，“+”表示浑浊.

2.2火炭母总黄酮对细菌性阴道炎小鼠血清炎症因子的影响 检验小鼠血液中的炎症因子，模型组PCT值达到(1038.628±26.111)ng/mL，与其他处理组比较差异有统计学意义(F=481.455，P=0.000)，阳性组和火炭母总黄酮组PCT都降低。模型组CRP也达到最高为(613.703±15.182)ng/mL，与其他处理组比较差异有统计学意义(F=1127.656，P=0.000)，火炭母组CRP下降最多，其检验值为(65.499±0.376)ng/mL。模型组IL-6最高，检出值为(20.667±0.714)pg/mL，与火炭母总黄酮组和阳性组差异无统计学意义(F=3.328，P=0.077)。模型组和空白组IL-10的检出量很高，与阳性组和火炭母总黄酮组比较差异有统计学意义(F=5.852，P=0.020)，火炭母总黄酮无法提高IL-10的含量，其检验值为最低为(21.185±0.887)pg/mL。WBC计数结果：阳性组和火炭母总黄酮组小鼠血液白细胞计数明显下降，且差异有统计学意义(F=481.455，P=0.000)，火炭母总黄酮组的WBC最低，为(1.033±0.088)×109个。模型组的所有炎症因子包括白细胞计数都是最高的，说明造模成功且给药组的治疗效果良好。见图2。

2.3火炭母总黄酮对细菌性阴道炎小鼠阴道组织的影响 给药结束后在采血取样前对各组小鼠进行外阴症状观察，模型组阴道口有大量脓状物，且阴道口红肿。空白组、阳性组、火炭母总黄酮组小鼠阴道口无脓状物。通过显微镜观察切片可见，模型组的小鼠阴道组织基底层鳞状细胞被破坏，宫颈柱状细胞出现大量细胞核缺失，组织中有大量炎症细胞浸润，说明造模成功。空白组的阴道和宫颈的上皮细胞排列规则，组织中无炎症细胞浸润。阳性对照组中，有发现细胞出现细胞核缺失，但是基本上恢复较好，未发现炎症细胞浸润，说明左氧氟沙星对细菌性阴道炎的治疗效果良好。火炭母总黄酮组具有治疗效果，组织切片中可见缺核细胞属造模形成，上皮逐渐光滑，炎细胞浸润减少。见图3、图4。

3 讨论

白细胞计数病理性升高最常见的原因是感染，尤其是细菌感染，且感染程度往往与白细胞数量增多成正比[12]。因此，白细胞计数经常成为细菌感染的生物指标。而且白细胞当中的单核细胞可分泌多种细胞因子包括IL-6、IL-10参与对炎症和免疫反应的调控。关于CRP的研究已经有70多年的历史，传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志。与C反应蛋白不一样，细菌感染时几乎所有的外周组织都参与PCT的产生,现在PCT已成为一个诊断细菌感染重要的标志物[13-14]。

图2 不同处理组小鼠血清炎症因子

注：图中短柱指平均值标准误，小写字母指差异显著(单因素方差分析，DMRT多重比较，P<0.05)。model为阴性对照模型组，control为空白对照组，positive为阳性组对照组，P. chinense为赤地利总黄酮处理组。

图3 各处理组小鼠外阴恢复情况

注：Model为模型组，Control为空白对照组，Positive为阳性组，P. Chinense为火炭母总黄酮组

图4 不同处理组小鼠阴道组织显微结构

在对ICR小鼠造模后，当小鼠阴道受到细菌感染时，模型组的白细胞计数增多，这些单核细胞会分泌促炎因子IL-6和抗炎因子IL-10。但是，细菌自然凋亡后释放内毒素，刺激单核细胞分泌IL-6等促炎因子，继而刺激甲状腺以外的组织和细胞释放PCT入血液，因此模型组的PCT含量比其他组高。另外由于IL-6的大量存在，诱导了急性蛋白CRP的产生，这个结果说明IL-6会促进炎症的发展[15]。在H.E染色切片中也证实了这个推测，细菌感染后的上皮组织基底细胞和宫颈柱状细胞都出现了大量的破裂和空泡，显示细胞受破坏和凋亡，而且上皮组织中有大量炎细胞浸润。火炭母总黄酮能够降低血液中WBC、PCT以及CRP，起到抗炎作用，然而小鼠血清中IL-6高表达，IL-10低表达，说明火炭母总黄酮不是通过调节细胞因子白介素来起到抗炎作用，这个机理有待下一步研究。在组织切片中阴道上皮基底层鳞状细胞和宫颈柱状细胞都曾经受到攻击，出现了不同程度的破坏，但是在给药以后的恢复程度良好，组织中仅有个别单核细胞存在。

综上所述，火炭母总黄酮局部给药可以杀菌并降低由细菌感染引起的炎症因子，很好地治疗细菌性阴道炎。