双酚A对高脂饮食小鼠肝损伤与GSK3表达的影响

葛晓蕾，陆晓桐，张小飞，吴 明，杜志远，朱启星，沈 彤

双酚A(bisphenol A，BPA)是一种常见的环境内分泌干扰物，主要做为合成聚碳酸酯、环氧树脂等塑料的单体，用于制造食品包装材料及输液袋等日常用品。当遇到热或强酸强碱时，BPA会从其中释出并进入机体，对人体造成危害[1-3]。研究[4-7]显示BPA暴露可导致肝脏明显损伤，而且炎性细胞因子参与其中，但BPA暴露诱导肝损伤中炎性细胞因子表达及调控机制目前知之甚少。糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)是体内广泛表达的多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其氨基端的丝氨酸(GSK3α-Ser21或GSK3β-Ser9)磷酸化可显著抑制其活性，调节炎性损伤[8]。该研究通过检测BPA暴露小鼠在正常饮食(normal diet，ND)和高脂饮食(high fat diet，HFD)喂养情况下肝损伤、炎性细胞因子白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达以及GSK3蛋白表达情况，探讨BPA暴露与HFD协同诱导肝脏炎性损伤与GSK3蛋白表达的关系。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器BPA(99.9%分析纯)购自国药集团化学试剂北京有限公司；二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)购自美国Sigma公司；BPA用DMSO溶解(DMSO终浓度不超过1%)；兔Anti-GSK3α抗体、Anti-GSK3α-S21抗体、Anti-GSK3β抗体、Anti-GSK3β-S9抗体购自美国Abcam公司；兔Anti-IL-1β抗体、Anti-TNF-α抗体购自武汉Elabscience生物公司，小鼠抗β-Actin单抗和通用超敏组化试剂盒、辣根过氧化物标记山羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物标记山羊抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；倒置荧光显微镜 IX73购自日本奥林巴斯有限公司；ELX800 酶标仪购自美国Bio-Tek公司；Fine-do X6显影仪购自上海天能科技有限公司；Microfuge®22R超速冷冻离心机购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2实验动物及其处理SPF级4周龄雄性C57BL/6野生型小鼠96只，体质量(14.53±0.97)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于安徽医科大学动物实验中心清洁动物房，自由进食，温度(21±2)℃，湿度(50±5)%，12 h交替照明。适应性饲养1周后，随机分为8组，每组12只。ND(12%脂肪能量)和HFD(45%脂肪能量，购自南京协同医药有限责任公司)各喂养4组。ND和HFD喂养小鼠分别设溶剂对照、10、100和1 000 nmol/L BPA组，通过饮水暴露于BPA，每2 d换1次水以保持饮水中BPA含量。每日观察小鼠一般状态，记录饮水量和饲料消耗量，每周称体质量1次。8周和12周时分别麻醉颈椎脱臼处死小鼠6只，无菌收集肝脏组织，称质量并计算脏器系数，分别用于以下实验。脏器系数计算方法：脏器系数=脏器质量(g)/小鼠体质量(g)。本研究在安徽医科大学实验动物伦理委员会的批准下，按照安徽医科大学实验动物规范进行。

1.3HE染色观察小鼠肝脏组织病理学改变用10%中性福尔马林固定小鼠肝脏组织24 h，常规石蜡包埋(脱水、透明、浸蜡、包埋)，制成5 μm切片，苏木精-伊红(HE)染色，脱水，用二甲苯透明，中性树胶封装，显微镜下观察各组肝组织病理学变化。

1.4免疫组化染色(IHC)检测肝脏组织TNF-α、IL-1β的表达新鲜肝组织用4%多聚甲醛固定24 h，脱水，石蜡包埋，制成5 μm切片，正常脱蜡水合，用Triton X-100进行细胞通透，用正常羊血清封闭，甩去羊血清，用小鼠抗TNF-α抗体、抗IL-1β抗体4 ℃冰箱孵育过夜，室温下复温30 min～1 h，然后用过氧化物酶结合的二抗37 ℃孵育15 min，PBS充分清洗后，再用辣根酶在37 ℃孵育15 min。PBS充分清洗后，DAB显色，苏木素复染，干燥、封片，显徽镜下观察拍片。

1.5Westernblot检测肝脏组织GSK3α、GSK3α-S21、GSK3β、GSK3β-S9的表达肝脏组织匀浆后提取总蛋白并定量，经SDS-PAGE变性凝胶电泳分离，转至PVDF膜，纯水洗涤3次，加入一定浓度的一抗，包括Anti-GSK3α抗体、Anti-GSK3α-S21抗体、Anti-GSK3β抗体、Anti-GSK3β抗体、Anti-GSK3β-S9抗体蛋白(美国Abcam公司)，4 ℃过夜。复温后用TBST洗涤3次，加入稀释的二抗室温孵育1.5 h，最后用TBST再次洗涤(3×5 min)。将化学发光试剂A和B(美国Advansta公司)以1 ∶1混合并滴加到PVDF膜上，通过显影液显影。用凝胶图像处理系统(Image J软件)进行相对OD分析。GSK3α、GSK3α-S21、GSK3β、GSK3β-S9分子量分别为51、50、46、46 ku。

2 结果

2.1BPA暴露对小鼠一般状况和肝脏系数的影响实验期间，各组小鼠一般状态良好，未出现死亡现象。不同时间点，各组小鼠日平均饮水量和食物消耗量差异无统计学意义。与ND喂养小鼠比，同一时间点，8周和12周时各组间差异均无统计学意义。见表1。

2.2BPA暴露对小鼠肝脏组织病理学影响与ND喂养小鼠比，同一时间点HFD喂养小鼠肝脏组织肝小叶结构模糊，肝细胞排列紊乱，细胞肿胀明显，大泡样脂肪变性严重，炎性细胞浸润增多；ND或HFD喂养小鼠中，肝脏组织病理学改变呈BPA暴露剂量依赖性，12周时较8周时炎性浸润更显著。见图1。

2.3BPA暴露对小鼠肝脏组织TNF-α、IL-1β表达的影响与ND喂养小鼠比，同一时间点HFD喂养小鼠肝脏组织TNF-α和IL-1β表达明显增强；ND或HFD喂养小鼠中，肝组织TNF-α和IL-1β表达增强呈BPA剂量依赖性，而且12周时较8周时表达更明显。见图2、3。

表1 不同剂量BPA暴露ND和HFD喂养小鼠肝脏脏器系数

2.4BPA暴露对小鼠肝脏GSK3α、GSK3α-S21、GSK3β、GSK3β-S9表达的影响与ND喂养小鼠比，HFD喂养同时间点相同BPA剂量暴露小鼠肝组织GSK3β-S9和GSK3α-S21表达降低，差异均有统计学意义(GSK3α-S21：F=6.883，P=0.000；GSK3β-S9：F=50.285，P=0.000)；ND或HFD喂养小鼠中，肝组织GSK3β-S9表达降低呈BPA剂量依赖性，但GSK3α-S21表达无BPA剂量依赖性。ND或HFD喂养小鼠，肝GSK3α和GSK3β表达在各组间差异无统计学意义(GSK3α：F=0.147，P=1.000；GSK3β：F=0.027，P=1.000)。见图4～8。

图1 不同剂量BPA暴露ND和HFD喂养小鼠肝组织病理学观察结果 HE×200

图2 不同剂量BPA暴露ND和HFD喂养小鼠肝组织TNF-α 表达情况 IHC×200

图3 不同剂量BPA暴露ND和HFD喂养小鼠肝组织IL-1β表达情况 IHC×200

图4 不同剂量BPA暴露ND和HFD喂养小鼠肝GSK3α、GSK3α-S21、GSK3β、GSK3β-S9蛋白表达A：8周；B：12周

图5 BPA暴露对小鼠肝GSK3α蛋白相对表达量影响(n=3)

图6 BPA暴露对小鼠肝GSK3α-s21蛋白相对表达量影响(n=3)

图7 BPA暴露对小鼠肝GSK3β 蛋白相对表达量影响(n=3)

图8 BPA暴露对小鼠肝GSK3β-S9蛋白相对表达量影响(n=3)

3 讨论

环境低剂量BPA暴露与肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝炎等代谢性疾病的关系日益受到关注[9-10]。本研究中小鼠暴露的BPA最高剂量为1 000 nmol/L，以每天饮水量5 ml计算，对应的暴露剂量为22.8 μg/(kg·d)，仍低于欧洲食品安全局和美国国家环境保护局规定的参考剂量50 μg/(kg·d)。结果显示，此剂量BPA可导致小鼠肝组织病理学改变，出现大泡样脂肪变性，炎性细胞浸润增多等损伤。研究[7]表明可控性炎症在代谢性疾病的发生发展中起着关键作用。本研究的结果也显示肝脏组织中炎性细胞因子TNF-α和IL-1β表达均增加，且随着BPA剂量的增加而加重，且HFD组比ND组更加明显。表明低剂量BPA可诱导小鼠肝脏炎症性损伤，且与HFD具有协同作用，与相关文献[11-12]报道类似。但BPA与HFD协同作用的具体机制尚不明确。

研究[13]表明GSK3在机体内具有广泛的底物性，参与炎症介质如TNF-α、IL-1β、IL-6和胰岛素细胞的信号传导的调控，其丝氨酸残基(GSK3α-Ser21或GSK3β-Ser9)磷酸化时可抑制其活性，导致下游炎症细胞因子表达上调，因此被认为是炎症和自身免疫疾病中潜在的治疗靶点[14]。本研究表明，低剂量BPA诱导小鼠肝组织GSK3β-S9和GSK3α-S21表达降低，其中GSK3β-S9表达降低具有BPA剂量依赖性，且HFD组明显低于ND组，提示低剂量BPA暴露与HFD可共同促进GSK3活化，上调肝脏炎症因子的表达，导致肝脏炎性损伤。

综上所述，本研究结果显示低剂量BPA暴露可导致小鼠肝脏炎性损伤，且与HFD具有协同作用，而GSK3β-S9表达降低导致GSK3活化，进而上调炎症因子的表达，在其所致肝脏炎性损伤中发挥一定作用。本研究结果为BPA暴露，尤其是与HFD协同诱导肝损伤的发病机制提供基础资料，可为寻找控制BPA引发肝损伤的潜在靶点提供进一步的实验依据，对预防和治疗BPA暴露诱导的肝损伤及相关代谢综合征具有重要的理论和现实意义。但低剂量BPA暴露诱导肝损伤中，诱导GSK3β-S9表达降低的具体机制需进一步的深入探讨，而环境低剂量BPA暴露人群研究也是今后研究的方向之一。