TMEFF2启动子甲基化对膀胱癌增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

张文涛，张子威，毛士玉，郭亚东，张俊峰，王龙圣，吴 元，姚旭东

膀胱癌(bladder cance，Bca)是男性常见的泌尿系肿瘤之一，在中国，2015年Bca新发病例约8万[1-2]。非肌层浸润性Bca大约占Bca的75%，而肌层浸润性Bca约占25%。因此，发现和筛选新的肿瘤生物标志物对于Bca的预防、诊断和治疗具有重要意义。

研究[3]表明表观遗传学改变可以影响基因的表达，其与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。含表皮样生长因子和卵泡抑素结构域的跨膜蛋2(transmembrane protein with EGF and two follistatin motifs 2, TMEFF2)也称为增生性息肉病1，具有表皮生长因子样的跨膜蛋白和两个卵泡抑素样结构域。目前研究[4-5]证实，TMEFF2在前列腺癌、乳腺癌、肺癌中启动子高甲基化。而在Bca中，TMEFF2是否参与Bca的发生发展，其具体机制仍不明确。该文采用荧光定量PCR技术检测Bca患者尿液中TMEFF2基因的甲基化情况，并研究去甲基化对Bca生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1MethHC数据库基因甲基化与表达(DNA methylation and gene expression in Human Cancer, MethHC)数据库是基于肿瘤基因组图谱(the cancegenome atlas， TCGA)公共数据库，关注肿瘤基因表达和DNA甲基化的综合数据库，其中包括超过6 000个样本的18个人类癌症和6 548个芯片和12 567个RNA测序数据。在MethHC数据库中，选择“膀胱癌(bladder cancer, BLCA)”，在“gene search”中输入“TMEFF2”,在“gene region”中选择“promoter”(https://methhc.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)。

1.2病例资料收集2017年1月～2017年8月间，在同济大学附属第十人民医院20例Bca患者尿液及10例正常尿液标本。Bca患者尿液标本在手术前3 d 收集，将新鲜组织样本立即在液氮中快速冷冻并储存在-80 ℃直至进一步使用。30例标本在年龄、性别等方面差异均无统计学意义。该研究经同济大学附属第十人民医院伦理委员会批准，并获得患者或其直系亲属的知情同意。 该项工作也符合世界医学协会的道德准则(赫尔辛基宣言)。

1.3主要材料人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)、人膀胱移行癌细胞株(T24,UMUC3，EJ，5637)均购自上海细胞库；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′脱氧胞苷(5-aza-2′ deoxycytidine，5-Aza-dc)，CCK-8试剂盒购自美国 Sigma 公司；转染试剂LipofectamineTM3000购自美国 Invitrogen 公司；甲基化特异荧光PCR试剂盒购自上海纽思格生物医学科技有限公司；兔抗人TMEFF2抗体、Bcl2抗体和Bax抗体、羊抗兔二抗购自美国Abcam公司；预涂有Matrigel的Transwell小室购自美国Costar公司。

1.4主要方法

1.4.1患者尿液甲基化特异性荧光PCR 取5～50 ml尿液，3 000 r/min离心10 min，弃上清液，留沉淀用于DNA提取。采用磁珠法自动核酸提取仪进行核酸提取，经裂解与亚硫酸氢盐的转化反应并纯化。采用甲基化特异的实时荧光PCR进行扩增。反应条件：50 ℃、2 min，95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、40 s，循环40～45次。TMEFF2基因引物序列为F：5′-TTTGCCAGTTTGGTGCAGAA-3′；R：5′-GATTGAAG TTGGTTTGAGAACAGTCA-3′；P：5′-FAM-ACGAAGA TGCCGAGGATGTCTGGTGT-MGB-3′。内参ACTB引物序列为 F：5′-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAA GT-3′；R：5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′；P：5′-FAM-ACCACCACCCAACACACAATAAC AAACACA-MGB-3′。获得TMEFF2和ACTB的扩增曲线和荧光域循环次数(cycle threshold, CT值)。见图1B。利用ΔCt法进行相对定量的计算。

1.4.2膀胱癌T24细胞培养及5-Aza-dc处理 在含10%胎牛血清、含有双抗的RPMI-1640培养基中培养、传代并在6孔板上铺板。 当6孔板上细胞生长至70～80%时在实验组细胞中分别加入含5-Aza-dc的培养基，使其药物终浓度分别为5、10 μmol/L，对照组加入同体积的DMSO，细胞经5-Aza-dc连续处理3 d，每天更换新鲜配置的药物。

1.4.3膀胱癌T24细胞转染 常规培养T24细胞，传代并在6孔板上铺板。 当6孔板上细胞生长至80%～ 90%时，按照Invitrogen公司的Lipofectamine 3000转染试剂说明书进行操作，转染TMEFF2质粒(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，购自上海吉凯基因公司)，对照组转染空载质粒。

1.4.4Western blot检测 每孔加入40 μg蛋白样品，用10%SDS-PAGE湿转法电转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，同时用5%脱脂奶粉稀释一 抗(兔抗人TMEFF2、Bcl2和Bax抗体)，4 ℃过夜；加入羊抗兔二抗，室温孵育2 h， 显影。

1.4.5CCK-8实验 使用CCK-8检测细胞增殖速率。 将细胞以1×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并用5-Aza-dc加药5 d。向每个孔中加入10 μl CCK-8试剂，将细胞在37 ℃下保持2 h。 使用微孔板分光光度计测量450 nm处的吸光度(optical density，OD)值。

1.4.6细胞划痕迁移试验 在6孔板上每孔的左、中、右用20 μl枪头在水平垂直方向各划一条线。 用PBS洗细胞去除划下的细胞。 将培养基更换为无血清培养基以观察其迁移能力。拍照记录0、24、48 h细胞的迁移能力。

1.4.7Transwell侵袭实验 使用预涂有Matrigel的Transwell小室测量细胞侵袭能力。将5×104个加药细胞接种到不含FBS的RPMI-1640培养基(200 μl)中的每个24孔板中，并将600 μl含有10%FBS的细胞培养基加入到底部室中。将细胞在37 ℃培养箱中培养16 h。 16 h后，Transwell小室用冷PBS洗涤3次，上层小室中未迁移的细胞用湿棉签仔细擦拭，而过滤器另一侧的侵袭穿过的细胞，用70%乙醇处理30 min，然后用0.1%结晶紫染色10 min。在显微镜下观察细胞侵袭。

2 结果

2.1TMEFF2在MethHC数据库中甲基化表达情况在MethHC中，利用该网站中提供的TCGA数据库来源的432个膀胱样本，其中正常膀胱组织28例，膀胱肿瘤404例。 按上述条件搜索， TMEFF2有一个转录本NM_016192，其在Bca组织中甲基化水平明显高于正常组织(P<0.05)。见图1A。

2.2TMEFF2在人尿液甲基化水平增高检测的30例尿液样本中，20例为Bca患者，10例为正常人，对于TMEFF2甲基化水平，在Bca患者尿液中，16例发生高甲基化(80%)，而在正常人尿液中仅有2例发生高甲基化(20%)。使用Fisher确切概率法统计，差异有统计学意义(χ2=7.656，P<0.05)。见图1B、1C。

2.3TMEFF2蛋白在不同Bca细胞株中的表达降低Western blot实验结果显示，与SV-HUC-1细胞株相比，TMEFF2蛋白在T24、UMUC3、EJ、5637细胞株中表达均显著降低，差异有统计学意义(F=712.6，P<0.05)。见图1D。因此本实验选择T24细胞系作为实验细胞株。

2.45-Aza-dc处理转染质粒后TMEFF2蛋白表达明显增加5-Aza-dc处理后T24细胞TMEFF2蛋白表达量较未处理组表达量明显增加。当5-Aza-dc浓度为10 μmol/L时，TMEFF2表达量相对较高(F=286.6，P<0.05)，见图2A；因此，选择10 μmol/L为后续实验组的浓度。Western blot结果显示，与对照组比较，TMEFF2+组细胞中蛋白表达明显上调(t=90.9,P<0.05)。见图2B。

图1 TMEFF2基因和甲基化表达情况

图2 5-Aza-dc处理和转染质粒后TMEFF2蛋白表达情况

2.55-Aza-dc降低T24细胞增殖能力情况CCK-8检测5-Aza-dc处理前后T24细胞增殖能力情况，分别检测6、12、24、36、48 h的OD值，结果显示，5-Aza-dc处理组T24细胞在48 h的OD值较对照组显著降低，两组OD值差异有统计学意义(t=2.88,P<0.05)。见图3A。同时，质粒转染TMEFF2+组T24细胞在48 h的OD值较对照组也显著降低，两组OD值差异有统计学意义(t=2.815,P<0.05)，见图3B。

2.65-Aza-dc降低T24细胞迁移和侵袭为评估5-Aza-dc对Bca细胞迁移和侵袭能力的影响，首先，对T24细胞系进行细胞划痕试验。与对照组相比，处理组Bca细胞的迁移的能力显著降低。此外，通过预先涂有Matrigel的transwell小室也证明5-Aza-dc显著降低了T24细胞的侵袭性。见图4A、4B。同时通过高表达TMEFF2基因也证明其干扰了Bca细胞的迁移和侵袭。

2.75-Aza-dc促进T24细胞凋亡5-Aza-dc处理48 h后，提取T24细胞系蛋白，通过Western blot检测凋亡相关的蛋白，可以发现相较于对照组，B淋巴细胞瘤-2基因 (B-cell lymphoma-2,Bcl-2)明显下降，而Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X,Bax)显著上升，Bcl-2和Bax与对照组相比差异均有统计学意义(t=6.21,P<0.05；t=20.45,P<0.05)，由此可以证明5-Aza-dc可以促进Bca细胞的凋亡。在高表达质粒中，Western blot同样证明了TMEFF2促进了细胞凋亡，Bcl-2和Bax与对照组相比差异有统计学意义(t=15.87,P<0.05；t=20.66,P<0.05 )。见图4C。

图3 5-Aza-dc处理和转染质粒后TMEFF2后细胞增殖能力降低

图4 5-Aza-dc处理和转染质粒后TMEFF2后对膀胱癌迁移侵袭和凋亡的影响

3 讨论

通过检测30例尿液样本，Bca细胞系以及数据库验证了TMEFF2在Bca中低表达，并证明其甲基化水平高表达。利用去甲基化药物5-Aza-dc诱导TMEFF2高甲基化状态的Bca细胞去甲基化，当5-Aza-dc浓度为10 μmol/L，通过Western blot实验、CCK-8实验、划痕实验、Transwell细胞小室实验检测5-Aza-dc处理前后T24细胞相关生物学行为的变化，表明5-Aza-dc处理后TMEFF2表达水平升高，甲基化水平得到逆转，并抑制了Bca的增殖、迁移、侵袭并促进凋亡。同时，通过高表达TMEFF2也证明该基因能干扰Bca的相关生物学行为，进一步证明该基因在Bca发挥重要作用，并且高甲基化水平可能是其发挥作用的重要原因。

自2001年首次发现TMEFF2存在差异甲基化序列之后，目前已经在许多癌症中揭示TMEFF2的启动子处于高甲基化水平[6]。Sun et al[7]通过基因集富集分析和基因本体富集分析证实在胃癌中TMEFF2改变、细胞增殖、凋亡和DNA修复途径显著富集。Herbst et al[8]在转移性结直肠癌患者中发现TMEFF2的甲基化与预后不良相关，也有研究[9]证实，通过其CpG岛(CpG island)的甲基化，导致基因的表观遗传沉默，从而抑制癌细胞的凋亡。而在Bca中，Monteiro-Reis et al[10]研究了TMEFF2甲基化水平的表达情况，然而对其具体机制在Bca中仍无深入研究。因此在本文中，当应用去甲基化药物后，干扰了Bca细胞系的增殖、迁移、侵袭和凋亡。这些研究也为探讨Bca发生机制提供新的方向。

DNA的表观遗传改变可以调节正常细胞和肿瘤细胞中的基因表达。DNA甲基化是DNA的表观遗传改变调节基因表达的常见机制。在许多基因的启动子区周围，存在许多以CpG二核苷酸成簇形成CpG岛。在许多人类恶性肿瘤中，CpG岛的高甲基化抑制肿瘤抑制基因的表达，即表观遗传沉默[11]。近年来研究[12]表明，在肿瘤发生的早期DNA的异常甲基化比基因突变更为频繁，因此与正常人相比，肿瘤患者中甲基化的基因可能是潜在的生物标志物。膀胱是作为尿液的暂时储存的器官，其尿液中基因甲基化水平可能更能反映膀胱的状态。Jarmalaite et al[13]报道了通过检测一组基因的甲基化水平，来预测浅表Bca是否会进展为肌层浸润性Bca。并证实启动子甲基化作为Bca疾病进展期预后的有价值生物标志物的分析。在Bca中，Costa et al[14]报道了通过检测尿液中一组包括TMEFF2基因的甲基化水平来诊断Bca，其敏感性达到94%、特异性达到90%, 然而该项研究样本量并不大，并且未对其机制进行深入研究。因此，TMEFF2在Bca中甲基化是否可以作为一个潜在的诊断性标志物，还需要更多的临床样本进一步证实。

综上所述，本研究从大数据库水平、尿液水平、细胞系水平验证了Bca中TMEFF2基因甲基化的变化，并影响了其生物学行为，表明Bca的发生发展可能受表观遗传影响。当然本研究的不足之处有：① 未能在更大尿液样本中验证。② 未能在Bca组织中验证其表达情况。③ 未能对收集标本进行随访研究。因此，在接下来的研究中希望开展大样本多中心的研究，并希望将该基因尿液的甲基化检测应用在Bca的早期筛查中。