优选缺血/再灌注损伤模型的建立条件

蔡 琳

(徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州 221006)

1 实验材料

1．1 药材与试剂

四甲基偶氮唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，DMEM/F12培养基，胰蛋白酶，胶原酶，5－溴－2－脱氧尿嘧啶核苷(5－BRDU)，胎牛血清(FBCS)，青霉素，链霉素。

1．2 仪器与设备

CO2培养箱，生物洁净工作台，倒置相差显微镜，Milli－Q超纯水处理装置，酶标仪，不锈钢正压滤器，旋转蒸发仪，循环水式真空泵，恒温水浴锅，电子天平:，真空干燥箱，血球计数板，96孔无菌培养板，200目细胞筛。

手术器械:手术刀、手术剪、镊子、5 mL无菌注射器、1 mL无菌注射器、50 mL灭菌锥形瓶、碘酒、75%酒精。

2 实验过程与结果

2．1 连二亚硫酸钠(Na2 S2 O4)诱导心肌细胞缺血/再灌注损伤模型的建立

将细胞按照5．0×105个/mL接种于96孔板上，置于37℃，5%CO2培养箱中培养72 h作为实验细胞。实验分为①正常对照组:正常的高糖培养液培养;②低糖培养液组;③Na2S2O4模型组:同一板上不同列加入浓度分别为800、400、200、100、50μmol/L的Na2S2O4溶液+低糖培养液组作用1 h后，换成正常的高糖培养液继续培养。根据MTT法检测吸光度值A492，计算细胞活力，以确定最佳损伤浓度［1］。

2．2 MTT法药效检测

2．2．1 实验原理

MTT法是检测细胞增值的经典方法，可间接反映细胞的数目。活细胞线粒体中含有脱氢酶，脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶状甲瓒(Formazan)颗粒，沉淀在细胞细胞内和细胞周围，而死细胞无此功能。在一定细胞浓度范围内，MTT结晶物形成的量与细胞的数目成正比。用二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶标仪检测其光密度值大小可以用Formazan的多少，间接反映细胞数量，即反映细胞的活力。

2．2．2 具体方法

取培养2～3 d，处于对数生长期、生长状态良好的细胞96孔培养板，每孔100μL，继续培养约12 h待细胞贴壁完全。设加药试验孔、空白对照孔(加细胞，但不加药物)和空白调零孔(只加培养基，酶标仪调零用)，每组设5个复孔。继续培养48 h，每孔加20μL(5 mg/mL)MTT，继续培养4 h后吸净孔内上清液，每孔加入150μLDMSO。在微量振荡器上振摇10 min使紫色结晶溶解。用酶标仪在492 nm处扫描，测定吸光值(OD);计算细胞存活率和损伤抑制率［2］。

细胞存活率=OD实验/OD对照×100%。

2．2．3 实验数据的处理

实验数据用X(－)±S表示。P＜0．05或P＜0．01提示有异显著差或高度显著性水平。采用SPSS16．0统计软件进行处理，组间比较用单因素方差和LSD检验分析。

2．3 实验结果

2．3．1 存活心肌细胞确认

倒置显微镜下，胰蛋白酶与胶原酶Ⅰ的混合溶液消化后的心肌细胞呈圆形，悬浮。台盼蓝计数示心肌细胞存活率达96%。4 h后开始逐渐贴壁，高度折光，初为放射状的圆形，后为梭形，细胞在瓶壁逐渐展开、伸出伪足，似岛屿状，变为三角形、多边形等不规则的形态。24 h后可见细胞陆续伸出伪足。细胞团最先开始搏动，随后，可见单个细胞开始搏动，搏动频率各异，多在50～120次/min次左右。48 h大部分细胞都伸出伪足，形成不规则的星形，同步搏动频率为60～90次/min［3－4］。

2．3．2 Na2S2O4损伤浓度与细胞存活率的关系

取接种完成的96孔板，随机分成6组，①正常对照组:不进行任何处理，只加相应体积的DMEM/F12培养液，温度为37℃、5%CO2饱和湿度的条件下常规培养;②缺血/再灌注性损伤模型组:分别加入800、400、200、100、50 μmol/L 的 Na2S2O4溶液，在温度为37℃、5%CO2饱和湿度的条件下常规培养1 h后，换成正常的DMEM/F12培养液，继续在在温度为37℃、5%CO2饱和湿度的条件下常规培养［5－6］。MTT法检验结果见表1与图1。

表1 Na2 S2O4损伤浓度与细胞存活率的关系

图1 Na2 S2 O4损伤浓度与细胞存活率的关系

以正常对照组心肌细胞的吸光度值作为对照，对不同浓度Na2S2O4损伤模型组心肌细胞进行活力测定。结果显示，各浓度 Na2S2O4(800、400、200、100、50 μmol/L)损伤组心肌细胞的活力均有所下降，与正常浓度组比较均有显著性差异(P＜0．05)，且Na2S2O4对心肌细胞的损伤效应呈剂量依赖性，随浓度增加，逐渐出现细胞功能改变，凋亡甚至死亡。根据文献报道，低浓度的Na2S2O4主要造成心肌细胞的氧化损伤，而高浓度的心肌细胞造成缺血/再灌注损伤。综合上述实验结果，参照文献，本实验采用选择400μmol/L的Na2S2O4损伤1 h建立心肌细胞的缺血/再灌注损伤模型［7－8］。

2．3．3 Na2S2O4损伤时间与细胞存活率的关系

表2 Na2 S2 O4损伤时间与细胞存活率的关系

图2 Na2 S2O4损伤时间与细胞存活率的关系

取接种完成的96孔板，随机分成6组，①正常对照组:不进行任何处理，只加相应体积的DMEM/F12培养液，温度为37℃、5%CO2饱和湿度的条件下常规培养;②缺血/再灌注性损伤模型组:分别加入400μmol/L的Na2S2O4溶液，在温度为37℃、5%CO2饱和湿度的条件下分别常规培养 0．5、1、2、4、8 h 后，换成正常的DMEM/F12培养液，继续在在温度为37℃、5%CO2饱和湿度的条件下常规培养。MTT法检验:结果见表2，图2。

以上实验结果可知，随着损伤剂作用时间的延长，细胞的存活率明显下降，为使实验以满足冠心病的心肌损伤的实际要求，且更加具有可信性，本实验选择存活率在50%左右剂量为最佳的剂量，因此选择浓度为400μmol/L的Na2S2O4损伤心肌细胞1 h作为心肌细胞缺血/再灌注性损伤的最佳剂量。

3 小结

低浓度的Na2S2O4主要造成心肌细胞的氧化损伤，而高浓度的心肌细胞造成缺血/再灌注损伤。随着损伤剂作用时间的延长，细胞的存活率明显下降，为使实验以满足冠心病的心肌损伤的实际要求，且更加具有可信性，本实验选择选择浓度为400μmol/L的Na2S2O4损伤心肌细胞1 h作为心肌细胞缺血/再灌注性损伤的最佳剂量。