N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺葡萄糖醛酸苷的高效制备

孔水仙,白洪越,王 宇,侯熙彦,吕 侠

(1. 大连民族大学生命科学学院,生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116600；2. 大连医科大学附属第二医院 辽宁 大连 116027 )

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(Uridine 5'-diphospho-glucuronosyltransferase,UGTs)是一种重要的II相代谢酶，介导各类葡萄糖醛酸结合反应[1]。UGTs酶活性升高、降低及活性消失，无疑会直接导致UGTs参与代谢清除为主的物质在人体内的血浆药物浓度降低或升高，进而导致药效的缺失/减少或毒性作用的产生。N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺(NBHN)能够被UGTs酶广泛快速代谢，生成单一的代谢产物N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺葡萄糖醛酸苷(NBHNG)，该产物具有较好的荧光属性，使得NBHN能够作为UGTs酶广谱荧光探针底物，进行各个亚型UGTs酶活性的同时检测[2]。再者NBHNG也被作为探针底物用于β-葡萄糖醛酸苷酶的活性检测[3]。本文首先考察了不同种属动物肝微粒体催化NBHN发生葡萄糖醛酸化反应的转化效率,筛选出能够高效转化NBHN的酶源。 同时,应用固相阴离子交换柱实现了目标产物的特异性收集、高效分离及纯化，并对其结构进行了表征，获得了纯度大于95%的NBHN葡萄糖醛酸苷产物单体。

1 实验部分

1.1 试剂

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸钠盐(UDPGA)、聚氧乙烯十六烷基醚(Brij58)、MgCl2和三羟甲基氨基甲烷(Tris)均购自Sigma公司; 人肝微粒体(HLM)、食蟹猴肝微粒体(CyLM)、大鼠肝微粒体(RLM)、小鼠肝微粒体(MLM)、豚鼠肝微粒体(GLM)、比格狗肝微粒体(DLM)、猪肝微粒体(PLM)、牛肝微粒体(BLM)和兔肝微粒体(RaLM)均购自瑞德肝脏疾病研究有限公司;C18WAX 阴离子交换固相色谱柱购自大连思谱有限公司。

1.2 实验过程

1.2.1 NBHNG的制备与鉴定

在UGTs反应体系中依次加入猴肝微粒体(0.5 mg/mL)，NBHN(500 μmol/L),Tris-HCl(50 mmol/L),及MgCl2(50 mmol/L)，再加入UDPGA(40 mmol/L)起始反应。37 ℃下孵育 5 h 后,在上述反应体系中加入乙腈终止反应,于高速冷冻离心机中离心20 min(4℃，20，000×g)。取上清液于UPLC-UV-ESI-MS分析NBHN生成NBHN葡萄糖醛酸苷产物的转化率。混合液加入C18WAX固相萃取柱进行富集、分离和纯化。采用UPLC-UV-MS对洗脱液中目标产物进行鉴定、监测及纯度分析。含有NBHN葡萄糖醛酸苷的洗脱液经旋转蒸发后即得单体目标产物。所得产物通过紫外，质谱和核磁共振进行结构表征。

1.2.2 NBHNG紫外光谱和荧光发射光谱的绘制

将目标产物配置成浓度为10μmol/L的Tris-HCl-乙腈混合液(1∶1)，分别吸取200 μL置于96孔透明酶标板和黑色酶标板中，用多功能酶标仪分别测定NBHN葡萄糖醛酸化产物的紫外吸收光谱(300～800 nm)和荧光发射光谱(400～800 nm)。

1.2.3 NBHNG标准曲线的绘制

首先，配制一系列不同浓度的NBHNG标准溶液(0,3.9,7.8,15.6,31.25,62.5,125,250,500,1000,2000,8,16,2500和3750 nmol/L),取各浓度标准溶液2 μL于pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液中(200 μL)并加入等体积乙腈。然后，吸取200 μL置于96孔黑色酶标板中，使用多功能酶标仪测定NBHNG的荧光强度，激发波长和发射波长分别设置为362 nm和450 nm。最后，以NBHNG标准溶液浓度为横坐标，NBHNG的荧光强度为纵坐标,绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 种属差异实验结果

9种动物肝微粒体催化NBHN发生葡萄糖醛酸化反应的高效液相色谱分析结果如图 1(a)所示,当底物NBHN终浓度为500 μmol/ L，各种属肝微粒体蛋白终浓度为0.5 mg/mL时，通过5h的孵育后，9种动物肝微粒体均能够催化NBHN发生葡萄糖醛酸化反应，且转化效率均超过50%。CyLM,RLM,MLM,GPLM,PLM,DLM,RaLM,BLM和HLM的转化率分别为97.6%,70.6%,72.0%,89.1%,86.9%,78.1%,83.4%,93.9%和52.9%。结果如图 1(b)所示,在正离子模式下扫描,其代谢产物准分子离子峰[M+H]+,m/z:446.15,表明该代谢产物的分子量为445.15,比底物NBHN的分子量增加了176,初步确定该产物为NBHN的单葡萄糖醛酸化产物。

2.2 NHBNG结构表征

NBHNG浅黄色粉末(乙腈)，紫外最大吸收波长为240 nm和360 nm，结合核磁共振氢谱和碳谱推测其分子式为C22H23NO9。从13C NMR 中发现，出现6个新的葡萄糖醛酸的碳信号(δ100.1,73.3,75.7,71.5,75.7,170.0)。从远程相关谱图HMBC谱中看到(δ5.40) 的葡萄糖醛酸的端基氢信号与C-4(δ157.8)有相关。1H NMR 中产物的葡萄糖醛酸特征信号端基质子 H(δ5.40,J=7.2Hz)偶合常数大于7,再次证实其为β构型糖苷键。因此,可确定NBHN在猴肝微粒体的催化下生成了NBHN-β-D-葡萄糖醛酸苷结合物。

2.3 NBHNG紫外光谱和荧光发射光谱的绘制

结果表明,NBHN在UGTs酶的催化作用下可生成具有较好荧光属性的产物NBHNG. 通过在单位时间内检测NBHNG荧光信号强度的变化,可实现复杂生物体系中多种UGTs亚型酶活性的高通量检测及其各亚型UGTs酶抑制剂的快速筛选.

Fig.2 Absorption (a) and emission (b) spectrum of NBHNG

2.4 NBHNG标准曲线的绘制

借助多功能酶标仪荧光检测法构建了NBHNG的标准曲线如图 3所示,可见NBHNG在 0 ～3.75 μmol/ L 浓度范围内其荧光强度与浓度呈线性关系,回归方程为y=21.64x+700.8,R2=0.9997。NBHNG的标准曲线的绘制对于后续多种UGTs亚型酶活性的定量检测、酶动力学实验及各亚型UGTs酶抑制剂的抑制常数的测定具有重要意义。

Fig.3 Calibration curve of NBHNG

3 结论

本文利用猴肝微粒体能够高效转化NBHN生成NBHN的单葡萄糖醛酸苷(NBHNG)产物，实现了NBHNG的高效生物合成。同时，借助C18WAX固相萃取柱实现了NBHNG的特异性收集、高效分离及纯化。该生物合成法转化效率高、目标化合物纯度高、产物后处理及制备过程较为简单,为NBHNβ-D-葡萄糖醛酸苷的高效制备提供了新方法.