响应面优化超声辅助提取黄槿叶总黄酮工艺及其亚硝酸盐清除能力

(漳州职业技术学院食品工程学院,福建漳州 363000)

黄槿(Hibiscustiliaceus)又名糕仔树、海麻桐、木麻、黄木槿和桐花等，为锦葵科木槿属植物[1]。黄槿耐碱、耐热、耐瘠、耐旱、抗风、萌芽强、易移植,主要生长于我国的广东、福建、台湾、海南和广西等沿海省区的沿海岸或潮水能到达的河岸上[2-3]。黄槿叶是一种潜在的食用和药用植物,逐渐受到了人们的关注,张小坡等[4]采用柱色谱对黄槿枝叶70%乙醇提取物进行了分离,得到14个化合物,李晓菲等[5]利用气-质联用仪对黄槿叶片的挥发油和脂肪酸进行了测定,得到酚类、醛酮类、醇类等54种化合物。黄酮是一种广泛存在于植物体中含有C6-C3-C6基本骨架的一类天然高分子化合物,具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血脂、治疗心脑血管疾病等多种生理与保健功能[6]。迄今为止,尚未有对黄槿叶总黄酮的提取工艺及活性的系统研究。本文以漳州产黄槿叶为原料,研究了黄槿叶的超声波辅助提取工艺,并对总黄酮对亚硝酸盐的清除作用进行了探讨,以期为漳州黄槿叶资源的开发与利用提供可行性的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄槿叶 采于漳州市九湖公园;芦丁标准品 上海沪宇生物试剂公司;其它试剂 均为国产分析纯。

KQ-100DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;UV-7504型紫外可见分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总黄酮的提取 用蒸馏水将采摘的黄槿叶洗净,在25 ℃的室温下晾干,后于50 ℃的干燥箱中干燥至恒重,用粉碎机粉碎,筛选60～80目的粉末备用。准确称取1.00 g的备用的黄槿叶粉末,装入100 mL的圆底烧瓶中,加入一定体积和一定浓度的乙醇并摇匀,后置于超声波清洗器中,在一定的温度下,超声提取一定的时间,提取结束后,定容至50 mL。

1.2.2 总黄酮含量的测定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[7],在波长510 nm下绘制芦丁的标准曲线,并线性回归得方程y=7.6142x+0.0003,R2=0.9998。取在不同条件下所得的提取液进行显色并测试,代入回归方程,求出黄槿叶总黄酮的得率。

式中:b为黄槿叶总黄酮质量浓度,mg/L;V为提取液体积,L；m为称取的黄槿叶质量,g。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 超声温度对总黄酮得率的影响 以超声时间30 min、乙醇浓度60%(v/v,下同)和液料比30∶1 mL/g为固定水平,分别考察超声温度为40、50、60、70、80 ℃时对黄槿叶总黄酮得率的影响。

1.2.3.2 超声时间对总黄酮得率的影响 以超声温度70 ℃、乙醇浓度60%和液料比30∶1 mL/g为固定水平,分别考察超声时间为10、20、30、40、50 min时对黄槿叶总黄酮得率的影响。

1.2.3.3 乙醇浓度对总黄酮得率的影响 以超声温度70 ℃、超声时间30 min和液料比30∶1 mL/g为固定水平,分别考察乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%时对黄槿叶总黄酮得率的影响。

1.2.3.4 液料比对总黄酮得率的影响 以超声温度70 ℃、超声时间30 min和乙醇浓度60%为固定水平,分别考察液料比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g时对黄槿叶总黄酮得率的影响。

1.2.4 响应面优化试验 根据单因素实验的结果对影响黄槿叶总黄酮得率的超声温度(A)、超声时间(B)、乙醇浓度(C)和液料比(D)四因素进行Box-Behnken试验设计。因素编码与水平见表1。

表1 响应面因素与水平表Table 1 Factors and levels table of response surface methodology

1.2.5 总黄酮对亚硝酸盐清除率的测定 分别在25 mL的具塞比色管中配制0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mg/L的黄槿叶总黄酮溶液,分别加入10.0 mL pH为3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和1.0 mL 50 g/mL的NaNO2溶液,并置于37 ℃的水浴锅中保温1 h,保温结束后,加入2.0 mL 0.4%(w/v)的对氨基苯磺酸,静置5 min,再加入1.0 mL 0.2%(w/v)的盐酸萘乙二胺,定容至25 mL,静置15 min,在540 nm处测得吸光度A,黄槿叶总黄酮溶液浓度为0时的吸光度为A0,并以VC为对照,分别计算亚硝酸盐的清除率。

1.3 数据统计及分析

采用Excel 2003、Origin 7.5和Design-Expert 8.05b进行数据统计、分析及图表制作。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声温度对总黄酮得率的影响 由图1可知,当超声温度在40～70 ℃时,随着温度升高,总黄酮得率也增大,这是因为温度升高,加快了溶剂与黄槿叶黄酮分子之间的溶解与渗透能力,使得总黄酮得率增大;但当超声温度大于70 ℃时,过高的超声温度会破坏部分不稳定的黄酮分子结构[8],造成得率降低。因此超声温度选择为70 ℃。

图1 超声温度对总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on yield of total flavonoids

2.1.2 超声时间对总黄酮得率的影响 由图2可知,当超声时间为10～30 min时,随着超声时间延长,总黄酮得率也增大,这是因为超声时间的延长,黄槿叶总黄酮能够更充分地溶出,使得得率增大;但当超声时间大于30 min时,过长的超声时间作用下,黄槿叶细胞结构破损,胞内其它杂质溶出,并与黄酮产生溶出竞争[9],使得得率下降。因此超声时间选择为30 min。

图2 超声时间对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of total flavonoids

2.1.3 乙醇浓度对总黄酮得率的影响 由图3可知,当乙醇浓度在40%～60%时,随着乙醇浓度增大,总黄酮得率也增大,这是因为乙醇浓度的增大,溶剂的极性降低,使得溶剂极性与黄槿叶总黄酮的极性更加接近,促进了黄槿叶总黄酮在溶剂中的溶解,使得得率增大;但当乙醇浓度过大时,极性较小的一些醇溶性杂质会与黄酮产生溶出竞争[10],导致了总黄酮得率的下降。因此乙醇浓度选择为60%。

图3 乙醇浓度对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of total flavonoids

2.1.4 液料比对总黄酮得率的影响 由图4可知,当液料比在10∶1～30∶1 mL/g时,随着液料比增大,总黄酮得率也增大,这是因为液料比的增大,增加了黄槿叶总黄酮的绝对溶解能力,使得得率增大;但当液料比过大时,黄槿叶颗粒内其他非黄酮类成分溶出量增大[11],导致了总黄酮得率的下降。因此液料比选择为30∶1 mL/g。

图4 液料比对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of liquid to material ratio on yield of total flavonoids

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 模型与方差分析 以黄槿叶总黄酮得率为响应值,应用Box-Behnken试验设计原理,选择超声温度(A)、超声时间(B)、乙醇浓度(C)和液料比(D)为影响因素,得出实验结果如表2,超声波辅助提取黄槿叶总黄酮得率数据模型的方差分析见表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2.2 模型的建立与分析 利用Design-Expert 8.05b软件对表2中的试验结果进行响应面分析,得到以超声温度(A)、超声时间(B)、乙醇浓度(C)和液料比(D)为工艺参数,黄槿叶总黄酮得率为响应值的二次多项式回归方程:

Y=37.61+3.0A-0.46B-1.50C-1.18D-0.71AB-0.23AC+0.075AD-0.23BC-0.54BD+2.64CD-3.97A2-6.18B2-4.75C2-6.02D2

根据表3的响应面方差分析可知,该回归模型p<0.0001,说明该模型达到了极显著水平;失拟项p=0.1241>0.05,不显著,说明该模型的可信度较高,拟合度好。模型的决定系数R2=0.9181,说明该模型可靠,有91.81%的实验值可以利用预测值来描述。由方差F值及p值可知,影响黄槿叶总黄酮得率的因素中,其主次顺序为超声温度(A)>乙醇浓度(C)>液料比(D)>超声时间(B),其中超声温度的一次项A,超声温度的二次项A2、超声时间的二次项B2、乙醇浓度的二次项C2和液料比的二次项D2对总黄酮得率影响极显著(p<0.01);乙醇浓度的一次项C、乙醇浓度与液料比的二次交互项CD对总黄酮得率影响显著(p<0.05);其他项对总黄酮得率影响不显著(p>0.05)。

2.2.3 响应面分析 响应面及等高线图可以直观地反映出黄槿叶总黄酮得率与所考察的超声温度(A)、超声时间(B)、乙醇浓度(C)和液料比(D)四因素中两两交互作用之间的关系。利用Design-Expert 8.05b软件绘制的响应面和等高线图如图5所示。

图5 各因素交互作用对总黄酮得率的影响Fig.5 Effects of interactive of various factors on yield of total flavonoids注:(A,a):超声时间和超声温度;(B,b):超声温度和乙醇浓度;(C,c):超声温度和液料比;(D,d):超声时间和乙醇浓度;(E:e):超声时间和和液料比;(F,f):乙醇浓度和和液料比。

由图5(A,a)可知,超声温度和超声时间的二次交互项AB对总黄酮得率的影响不显著,总黄酮得率随着超声温度的升高和超声时间的延长均出现先增大后减小的趋势。由图5(B,b)可知,超声温度和乙醇浓度的二次交互项AC对总黄酮得率的影响不显著,总黄酮得率随着超声温度的升高和乙醇浓度的增加均出现先增大后减小的趋势。由图5(C,c)可知,超声温度和液料比的二次交互项AD对总黄酮得率的影响不显著,总黄酮得率随着超声温度的升高和液料比的增加均出现先增大后减小的趋势。由图5(D,d)可知,超声时间和乙醇浓度二次交互项BC对总黄酮得率的影响不显著,总黄酮得率随着超声时间的延长和乙醇浓度的增大均出现先增大后减小的趋势。由图5(E,e)可知,超声时间和液料比二次交互项BD对总黄酮得率的影响不显著,总黄酮得率随着超声时间的延长和液料比的增大均出现先增大后减小的趋势。由图5(F,f)可知,乙醇浓度和液料比的二次交互项CD对总黄酮得率的影响显著,当乙醇浓度料小时,液料比对总黄酮得率的影响较大,最初随着乙醇浓度的增加,总黄酮得率迅速增大,而后随着乙醇浓度的增加反而又开始下降。

2.2.4 最优条件验证 根据响应面方程进行分析得到黄槿叶总黄酮的最佳提取工艺为:超声温度73.87 ℃,超声时间29.50 min,乙醇浓度57.96%,液料比28.62∶1 mL/g,预测的总黄酮得率为38.43 mg/g。为了方便对实验结果的验证,将优化条件修正为超声温度74 ℃,超声时间29 min,乙醇浓度58%,液料比29∶1 mL/g,并进行3次平行试验,得到黄槿叶总黄酮的得率为38.15 mg/g,与预测的相对误差为0.73%,说明该回归方程对黄槿叶总黄酮得率的预测准确率高,可靠性强,可推广到实际生产中。

2.3 黄槿叶总黄酮对亚硝酸盐的清除能力

由图6可知,在0.2～3.0 mg/L范围内,随着浓度的增加,黄槿叶总黄酮对亚硝酸盐的清除率逐渐增加,其IC50为1.87 mg/L,当质量浓度为3.0 mg/L时,清除率达到69.58%,说明黄槿叶总黄酮与亚硝酸盐的清除率之间存在量效关系,黄槿叶总黄酮具有较好的亚硝酸盐清除能力,但效果弱于VC。

图6 总黄酮和VC对亚硝酸盐的清除率Fig.6 Nitrite scavenging rates of total flavonoids and VC

3 结论

通过单因素实验对影响黄槿叶总黄酮得率的因素进行了分析,确定了合适的提取条件,结合响应面法优化超声辅助黄槿叶总黄酮的提取工艺。结果表明,影响黄槿叶总黄酮得率的各因素主次顺序为超声温度>乙醇浓度>液料比>超声时间,最佳提取工艺条件为:超声温度74 ℃,超声时间29 min,乙醇浓度58%,液料比29∶1 mL/g,在此条件下黄槿叶总

黄酮的得率为38.15 mg/g,与预测的相对误差为0.73%,说明该回归方程对黄槿叶总黄酮得率的预测准确率高,可靠性强,且得到的黄槿叶总黄酮对具有较好的亚硝酸盐清除能力。