红树莓花色苷对D-半乳糖衰老模型小鼠的保护作用

, ,,Clint Taonaishe Chimbangu,,*

(1.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001;2.大连市农产品质量监测中心,辽宁大连 116037)

红树莓(RubusidaeusL.)悬钩子植物,柔嫩多汁,香气独特。树莓含有丰富的铁、铜、镁、钾等微量元素及SOD、VE、VC和多酚等抗氧化类物质[1-2]。花色苷是树莓中重要的功能性成分[3],其含量远高于苹果、草莓、葡萄等水果[4]。花色苷具有清除自由基、抗炎、抗氧化、抗血栓,预防心血管疾病、抗癌、减肥、改善视力、延缓衰老等生理活性[5-6],目前对于抗氧化活性研究较为深入。树莓花色苷有抗氧化、降血脂、抑菌活性,并对癌症、心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、肥胖[7-8]等具有预防作用。近些年来关于浆果类抗衰老方面的报道较多,例如沙棘、葡萄、蓝莓、樱桃等的多糖、色素、多酚等在延缓衰老、提高记忆力、增强机体体质等有很好的效果[9-12],同时发现树莓糖蛋白[13]也有一定的抗衰老作用,但关于树莓花色苷干预衰老过程研究并不多见,所以这为红树莓的加工利用提供了新思路。

衰老是由多方面因素相互作用的结果,表现为一系列机体变化和功能紊乱。通过持续注射一定量D-半乳糖模拟自然衰老过程,是公认的衰老研究的方法之一[14]。D-半乳糖在小鼠体内氧化产生大量自由基,迅速与细胞组分例如蛋白质、氨基酸、脂质等反应产生氧化产物,导致细胞膜通透性发生改变,使细胞代谢和功能形态发生改变,从而引起细胞衰老和死亡[14]。脂质过氧化作用还会导致胶原蛋白产生交联,而使皮肤松弛、色素沉积等[15]。

因此本实验预以D-半乳糖使小鼠为亚急性衰老模型,用红树莓花色苷(red raspberry anthocyanins,RRA)对其进行灌胃,通过观察小鼠器官指数、抗氧化酶活力及心脏和肾脏结构形态变化,评价树莓花色苷对机体衰老的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

树莓品种为费尔杜德(cv.Fertod Zamatos) 锦州七里河树莓种植基地,无损果迅速去除田间热、单体速冻后,置于-80 ℃冰箱中冻存备用;D-半乳糖粉剂 上海国药集团化学试剂有限公司;抗坏血酸(VC) 济南汇锦川化工有限公司;生理盐水 江苏苏中药业集团股份有限公司;甲醇 分析纯,天津市大茂化学公司;SOD测试盒、CAT测试盒、GSH-Px测试盒、MDA测试盒、HYP测试盒 南京建成生物工程研究所;苏木素-伊红染料 沈阳万类生物有限公司;二甲苯 济南汇丰达化工有限公司;SPF级雄性昆明(KM)小鼠60只 锦州医科大学动物实验中心,许可证号:SCXK(辽)2014-0004。

恒温水浴锅 上海雷韵试验仪器制造有限公司;FA2104电子天平 上海雷韵试验仪器制造有限公司;涡旋混合器 美国LABNET公司;高速组织捣碎机 上海标本模型厂;UV-1200紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;PHS-25 pH计 上海雷磁仪器有限公司;RE-1002旋转蒸发器 西安禾普生物科技有限公司;DS-040ST功率可调超声波清洗机 浙江东森电器有限公司;高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;组织研磨仪 上海净信实业发展有限公司;组织包埋机 美国Thermo公司;CUT4062石蜡切片机 德国SLEE公司;光学显微镜 日本Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 树莓花色苷提取 红树莓冻果与含0.05% HCl的甲醇溶液[16]按质量与体积比1∶15室温下用组织捣碎机破碎至无完整种子,再置于50 ℃、超声功率为500 W超声条件下提取1.5 h,抽滤去渣。重复超声提取2次,合并滤液,过硅藻土去除脂溶性杂质,45 ℃旋转蒸发至甲醇挥发完全,-80 ℃冷冻备用。

1.2.2 大孔树脂AB-8纯化红树莓花色苷粗提物 将1.2.1样品用2 mol/L HCl调节pH2,浓度调节为上样质量浓度2.3 mg/mL,上样流速1.7 mL/min,上样体积200 mL,树脂动态吸附达到饱和状态。60 mL 60%乙醇2 mL/min进行洗脱,45 ℃旋转蒸发去除乙醇,-80 ℃冷冻备用。花色苷含量测定[17]采用pH示差法:

花色苷含量(mg/100 g)=[(A515-A700)pH1-(A515-A700)pH4.5]×MW×DF×1000×V/(ε×1×m)×100

式(1)

式中:A515和A700分别为515和700 nm处的吸光度;MW为相对分子质量,以矢车菊-3-葡萄糖苷为标准449.4;DF为稀释倍数;ε为消光系数,26900 L·cm-1·mg-1;1为光程(1 cm)。V为提取液的总体积(mL);m为样品的质量(g)。

1.2.3 动物分组及给药 选择健康昆明小鼠60只,适应性饲养7 d,随机分6组:空白对照组、D-半乳糖模型组、VC阳性对照组、红树莓花色苷低剂量组(RRA-L)、中剂量组(RRA-M)和高剂量组(RRA-H),每组10只。于每日下午2点,空白对照组颈背部注射生理盐水,其余各组注射D-半乳糖400 mg/kg;空白对照组和模型组灌胃双蒸水,阳性对照组灌胃VC溶液100 mg/kg,花色苷低、中、高剂量组分别灌胃花色苷含量为20、100、500 mg/kg体重。每天进行注射及灌胃给药,持续8周。每周称量体重一次,调节注射及灌胃剂量。

1.2.4 检测样品的采集 末次给药,禁食24 h,自由饮水,并用10% Na2S涂于各组小鼠背部两肩胛处皮肤脱毛。第二天摘眼球取血(斜面静置20 min,于4 ℃、2000 r/min,离心10 min,取上清,即为血清),断颈处死,剪下脱毛皮肤,表2～表4同。铺平用打孔器取4块直径为1.4 cm左右的皮肤(去除结缔组织和皮下脂肪),并取心脏、肝脏、肾脏、胸腺和脾脏组织,剔去周围结缔组织。

表4 红树莓花色苷对D-半乳糖致衰老小鼠皮肤SOD、CAT、GSH-Px活力和HYP含量的影响Table 4 Effect of RRA on the activities of SOD,CAT,GSH-Px and the content of HYP in skin of mice

表2 红树莓花色苷对D-半乳糖致衰老小鼠肝脏SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的影响Table 2 Effect of RRA on the activities of SOD,CAT,GSH-Px and the content of MDA in liver of mice

1.2.5 器官指数的测定 将胸腺、脾脏、肝脏和肾脏组织于4 ℃生理盐水中洗去浮血,滤纸吸干水分,称重,计算器官指数:

器官指数(mg/g)=器官质量(mg)/小鼠体重(g)

式(2)

1.2.6 生化指标的测定 按照试剂盒测定血清和肝脏组织的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;检测皮肤SOD、CAT、GSH-Px活性和羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量。

1.2.7 组织切片观察 取小鼠心脏和肾脏组织,置于福尔马林中固定,再经过80%、90%、95%、100%梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片机切片,苏木素-伊红染色,中性树脂封片,在显微镜下观察变化情况。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 红树莓花色苷对D-半乳糖致衰老小鼠器官指数的影响

由表1可知，与空白对照组相比,模型组的胸腺指数、脾脏指数显著降低(p<0.05),模型组小鼠胸腺和脾脏萎缩,说明造模成功。脾脏和胸腺作为生命体重要的免疫器官,随着生命体的衰老,胸腺和脾脏出现体积缩小、功能减退,生命质量下降[18-19]。与模型组相比,树莓花色苷各剂量组胸腺和脾脏指数都有所提高,RRA-L胸腺指数提高,但差异不显著(p>0.05),RRA-M胸腺指数极显著提高(p<0.01),RRA-H胸腺指数显著提高(p<0.05);RRA-L脾脏指数与模型组比较显著提高(p<0.05),RRA-M、RRA-H脾脏指数与模型组比较极显著提高(p<0.01)。RRA-L、RRA-M、RRA-H胸腺指数和脾脏指数与阳性对照组相比,差异不显著(p>0.05),说明对于胸腺和脾脏指数而言,红树莓花色苷延缓衰老作用与VC接近。肝脏指数和肾脏指数较模型组都有一定的提高,但是结果差异不显著(p>0.05)。

表1 红树莓花色苷对D-半乳糖致衰老小鼠器官指数的影响Table 1 Effect of RRA on organ indexes of mice

2.2 红树莓花色苷对D-半乳糖致衰老小鼠肝脏SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的影响

2.3 树莓花色苷对D-半乳糖致衰老小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活力及对MDA含量的影响

根据表3,小鼠血清情况:模型组各种酶活性显著低于空白对照组(p<0.05),MDA含量模型组显著高于空白对照组(p<0.05)。RRA-L中SOD活性显著高于模型组(p<0.05);RRA-M中SOD、CAT活性显著高于模型组(p<0.05),GSH-Px活性极显著高于模型组(p<0.01),MDA含量显著低于模型组(p<0.05);RRA-H的SOD、GSH-Px活性极显著高于模型组(p<0.01),MDA含量极显著低于模型组(p<0.01)。另外,RRA-H中SOD、CAT和GSH-Px活性显著高于阳性对照组(p<0.05),RRA-M中CAT活性和RRA-H中MDA含量与阳性对照组相比,差异不显著(p>0.05),说明高剂量的红树莓花色苷对衰老小鼠保护作用良好。在以往研究中发现:将“黑美人”土豆花色苷、黑米花色苷及黑豆花色苷[23-25]作用于衰老小鼠,结果都显示小鼠血清及器官中SOD、GSH-Px活性显著提高,MDA含量下降,有本实验有着类似的结果。

表3 红树莓花色苷对D-半乳糖致衰老小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的影响Table 3 Effect of RRA on the activities of SOD,CAT,GSH-Px and the content of MDA in serum of mice

2.4 树莓花色苷对D-半乳糖致衰老小鼠皮肤SOD、CAT、GSH-Px活力及对HYP含量的影响

根据表4,模型组各酶类活性显著低于空白对照组(p<0.05),HYP是胶原纤维和胶原蛋白中主要的非必需氨基酸[26-27],是检测机体胶原代谢的重要指标,也是评价皮肤衰老的重要指标。HYP含量可以间接反映真皮内胶原蛋白含量的变化情况。与空白对照组相比,模型组SOD、CAT、GSH-Px活性和HYP含量显著降低(p<0.05);RRA-L中SOD、GSH-Px活性和HYP含量显著高于模型组(p<0.05);RRA-M中SOD、CAT、GSH-Px活性均显著高于模型组(p<0.05),HYP含量极显著高于模型组(p<0.01);RRA-H中SOD、CAT活性和HYP含量极显著高于模型组(p<0.01),另外RRA-H中CAT、GSH-Px活性及HYP含量与阳性对照组相比,差异不显著(p>0.05),SOD活性甚至优于VC阳性组作用(p<0.05),说明红树莓花色苷对延缓皮肤衰老、增加皮肤弹性起到一定的作用。与本结论类似的研究有:黑果腺肋花楸花色苷对紫外辐射所致人皮肤成纤维细胞有保护作用[28],黑果枸杞原花青素和紫薯花色苷[29-30]都可以修复皮肤氧化损伤。另外关于植物花色苷延缓衰老的研究还有:周波[31]等利用玉米紫色色素研究对黑腹果蝇影响,发现其延长黑腹果蝇寿命、增加最高寿命,并提高体内SOD活性;李亚巍[32]发现越橘花色苷对衰老小鼠学习记忆能力有提高作用。这说明植物花色苷在预防衰老方面有很广阔的前景,为红树莓资源的开发利用及消费者健康生活提供了更多的选择。

2.5 红树莓花色苷对D-半乳糖致衰老小鼠心脏组织的影响

图1a所示,正常心肌细胞数量多,排列规则,形态大小正常,细胞核呈卵圆形,核仁清晰,肌浆呈粉红色;图1b中模型组心肌细胞细胞明显减少,有出血点、见轻度固缩状细胞核,在组织中分布不均匀,有空泡;图1c中阳性对照组心肌细胞形态接近于空白组,排列整齐,细胞数量多;图1d、1e、1f中,低、中、高组小鼠较模型对照模型组有很大的改善,有少量出血,细胞排列混乱,心肌细胞呈短柱状、有分叉,细胞结构清晰,细胞数量增加。结果说明红树莓花色苷能缓解心脏衰老,对心肌细胞氧化损伤具有预防作用。

图1 小鼠心脏组织切片(HE,×400)Fig.1 Histopathology of heart tissues(HE,×400)注:a～c分别为:空白对照组、模型组、阳性对照组;d～f分别为:RRA-L组、RRA-M组、RRA-H组,图2同。

2.6 红树莓花色苷对D-半乳糖致衰老小鼠肾脏组织的影响

如图2a所示,正常肾小球分布密集,圆形或椭圆形,外观规整,肾小囊囊腔正常,肾小管管腔正常。在图2b中模型组肾小球体积增大,分布稀少,不规整,肾小囊囊腔明显增大,基底膜增厚,肾小管管腔增大,结构不清晰。图2d、2e、2f各剂量组相比于模型组肾小球数量明显增多,肾小囊囊腔有所减小,基底膜增厚不明显。随着剂量的增加,花色苷对于衰老损伤的肾细胞具有修复作用越来越好,本实验说明红树莓花色苷对D-半乳糖致衰老小鼠肾脏损伤具有抑制作用。

图2 小鼠肾脏组织切片(HE,×400)Fig.2 Histopathology of kidney tissues(HE,×400)

3 结论

本研究通过注射D-半乳糖建立小鼠衰老模型,观察红树莓花色苷对衰老的干预作用。结果表明:红树莓花色苷对衰老造成的胸腺和脾脏指数的下降有一定的改善作用,使衰老小鼠肝脏和血清中SOD、CAT和GSH-Px酶活性显著提高(p<0.05)、降低MDA含量(p<0.05),同时也显著提高皮肤组织中SOD、CAT、GSH-Px活力及HYP含量(p<0.05),对改善皮肤衰老状况起到积极的作用;通过病理切片观察到,红树莓花色苷对心肌细胞氧化损伤起到缓解作用,使小鼠肾小球结构逐渐恢复接近于正常状态,结构规整、数量增加,肾小管结构清晰,说明红树莓花色苷对于自由基造成的衰老有一定的抑制作用。