实时荧光PCR法鉴别玛咖及其掺假物芜菁

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(中国检验检疫科学研究院农产品安全研究中心,北京 100176)

玛咖(LepidiummeyeniiWalp)是十字花科独行菜属植物,药食两用,原产于南美洲秘鲁,现已在我国云南、四川、西藏、新疆等地大面积引种[1]。玛咖富含生物碱、芥子油苷、甾醇、脂肪酸、多酚、玛咖酞胺和玛咖烯等多种生物活性物质[2-4],作为重要的保健品和新资源食品原料,虽然当前产量不断攀升,但仍具有价格优势。由于芜菁(BrassicarapaL.)外形与玛咖极为相似,受经济利益驱使,不法商家将芜菁冒充玛咖,制成玛咖粉、玛咖片、玛咖饮品等谋取暴利,这给玛咖健康产业有序发展带来了严重负面影响。

目前鉴别玛咖真伪的主要技术包括显微镜法[5]、红外光谱[6-7]、气/液相色谱[8]、电子鼻[9]、普通PCR(Polymerase Chain Reaction)[10]、RPA(Recombinase Polymerase Amplification)[11]、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)[12]、DNA条形码[13]以及NMR(Nuclear Magnetic Resonance)[14]等。如通过对比玛咖与芜菁横切面和粉末颗粒的显微特征可鉴别两种植物[5],利用近红外光谱[6-7]、电子鼻[9]等技术结合化学计量学,构建模式识别模型可实现玛咖产地与等级的判别,以及采用气质联用质谱[4],分析玛咖挥发性组分的种类和数量差异来判定玛咖的产地和质量等。实时荧光PCR方法现已成为肉类[15-16]、谷物[17-18]、乳制品[19]等食品原料及制品中动植物成分种类鉴定的首选,部分检测方法已经标准化推广应用。防御素(defensin)是一类广泛存在于生物界的内源性抗菌肽。有文献利用玛咖defensin基因设计了可特异鉴定玛咖成分的普通PCR引物[10]。本研究根据defensin基因序列,分别设计了玛咖及掺假物芜菁特异引物探针,建立了玛咖原料及制品中玛咖与芜菁两种植物成分的实时荧光PCR检测方法,为鉴别玛咖真实属性提供了新的技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玛咖(L.meyeniiWalp)样品 13份,产地分别为云南(3份)、西藏(3份)、四川(3份)、新疆(3份)及秘鲁(1份);芜菁(B.rapa)样品 3份,收集自山东、河南及新疆(详见表1)，上述样品均经云南省农业科学院药用植物研究所李晚谊研究员生态学鉴定为玛咖和芜菁;马铃薯、红薯、木薯、山药、葛根、独行菜、油菜、芥菜、甘蓝、白菜、萝卜、胡萝卜、人参、花生、大米、玉米及黄豆等原料样品 均购于北京超市;人参玛咖片、玛咖压片糖果、玛咖粉、玛咖晶华固体饮料、玛咖人参固体饮料、黑玛咖干片及玛咖片等加工制品(编号S1～S7) 均购于北京商城(见表1);TaqMan®预混合液(4369016) 美国ABI公司;植物基因组DNA提取试剂盒(DP305) 天根生化科技(北京)有限公司。

表1 试验样品信息Table 1 The experimental samples information

BS电子天平 德国Sartorius公司;M20研磨机 德国IKA公司;7500实时荧光PCR仪 美国ABI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物与探针设计 植物通用引物探针引自文献[18],玛咖、芜菁特异引物探针是根据两种植物的defensin基因序列自行设计(表2),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 引物探针序列Table 2 The sequence of primers and probes

1.2.2 样品DNA提取 所有样品均采用天根生化科技(北京)有限公司植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)进行DNA提取,具体操作步骤按照说明书进行。

1.2.3 实时荧光PCR反应 反应体系:TaqMan®预混合液12.5 μL;上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL;探针(10 μmol/L)0.5 μL;DNA模板5 μL,用无菌水补至总体系为25 μL。

扩增程序:95 ℃预变性10 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 60 s,共运行45个循环。

1.2.4 方法特异性分析 采用玛咖、芜菁特异引物探针分别实时荧光PCR扩增13份玛咖、3份芜菁以及同为十字花科的独行菜、油菜、芥菜、甘蓝、白菜、萝卜和其它科属的马铃薯、红薯、木薯、山药、葛根、胡萝卜、人参、花生、大米、玉米及黄豆等33份样品DNA,以确证方法的特异性,扩增程序按照1.2.3,每个样品重复扩增3次。

1.2.5 方法灵敏度分析

1.2.5.1 绝对灵敏度 将已测定浓度的云南产玛咖(编号:YN1)及新疆产芜菁(编号:XJWJ)DNA,用无菌水稀释至浓度为100 ng/μL,各取10 μL浓度为100 ng/μL的DNA至90 μL无菌水中,得到浓度为10 ng/μL的DNA,由此依次10倍梯度稀释至1、0.1及0.01 ng/μL,按照1.2.3进行实时荧光PCR扩增,分析方法的绝对灵敏度,每个样品重复扩增3次。

1.2.5.2 相对灵敏度 取云南产玛咖(编号:YN1)及新疆产芜菁(编号:XJWJ)各100 g干燥块茎样品,分别用研磨机粉粹成60目粉末状。取10 g玛咖粉加入到10 g芜菁粉中,充分混合均匀,保证样品在芜菁粉中均匀散布,制成含有50%(w/w)玛咖成分的样品;取4 g含有50%(w/w)玛咖成分的样品加入到16 g芜菁粉中,充分混匀制成含有10%(w/w)玛咖成分的样品;取10 g含有10%(w/w)玛咖成分的样品加入到10 g芜菁粉中,充分混匀制成含有5%(w/w)玛咖成分的样品;取4 g含有5%(w/w)玛咖成分的样品加入到16 g芜菁粉中,充分混匀制成含有1%(w/w)玛咖成分的样品;取2 g含有1%(w/w)玛咖成分的样品加入到18 g芜菁粉中,充分混匀制成含有0.1%(w/w)玛咖成分的样品;按照此方法再依次制成玛咖粉中含有50%、10%、5%、1%及0.1%(w/w)芜菁成分的样品。取不同重量比的玛咖粉和芜菁粉样品,DNA提取后按照1.2.3进行实时荧光PCR扩增,分析方法的相对灵敏度,每个样品重复扩增3次。

1.2.6 方法适用性验证 为判定已建立方法是否适用玛咖制品中玛咖与芜菁成分的鉴别,研究中选取玛咖干片、糖果压片、干粉以及固体饮料等4类7份市售玛咖常见加工品(见表1,编号:S-1～S-7)进行测试,每个样品取样2份,提取DNA后先扩增18S rRNA基因以确保样品DNA提取的有效性,以避免假阴性结果发生;然后扩增玛咖和芜菁的defensin基因以判断样品中是否含有两种植物成分,每个样品重复扩增3次。

1.2.7 检测结果判定 样品经植物通用引物探针实时荧光PCR扩增时,出现明显的荧光扩增曲线,Ct值<45.0,视为样品DNA提取有效;否则DNA提取无效,应重新提取DNA,直至Ct值<45.0[20]。而经玛咖、芜菁引物探针扩增时,样品如出现明显的荧光扩增曲线,Ct值<40.0,则判定样品含有玛咖或芜菁植物源性成分;如Ct值≥45.0,则判定为不含玛咖或芜菁植物源性成分;如40.0

2 结果与分析

2.1 方法特异性

从NCBI数据库下载玛咖(GenBank.AY829229.1)和同属十字花科的芜菁(GenBank.AY383485.1)、油菜(GenBank.KC967208.1)、芥菜(GenBank.DQ191752.1)以及禾本科的玉米(GenBank.AJ849917.1)defensin基因序列,利用Clustal Omega在线软件进行比对,在序列差异区分别设计了玛咖与芜菁实时荧光PCR特异引物及探针(图1)。

图1 玛咖、芜菁、油菜、芥菜以及玉米defensin基因序列比对结果Fig.1 Alignment results of defensin gene sequence among maca,rappini,rape,mustard,and corn注:方框无灰色底纹标记序列为玛咖上、下游引物,方框有灰色底纹标记序列为玛咖探针;下划线无灰色底纹标记序列为芜菁上、下游引物,下划线有灰色底纹标记序列为芜菁探针。

采用植物通用引物探针扩增玛咖、芜菁、马铃薯、红薯、木薯、山药、葛根、独行菜、油菜、芥菜、甘蓝、白菜、萝卜、胡萝卜、人参、花生、大米、玉米及黄豆等33份样品DNA的18S rRNA基因,Ct值在(19.32±0.03)～(30.47±0.29)(表3),表明33份样品均提取到质量较好的DNA;采用玛咖引物探针对上述样品进行扩增的结果显示:13份玛咖样品均得到扩增,Ct值在(27.10±0.14)～(31.06±0.18),其它样品和空白对照(无菌水)无扩增,Ct值均为45.0(表3);经芜菁引物探针扩增,所有样品中3份芜菁和白菜样品产生典型荧光扩增曲线,Ct值在(29.78±0.17)～(32.35±0.11),其它样品及空白对照(无菌水)无荧光扩增信号,Ct值均为45.0(表3)。本实验结果表明,所设计的玛咖引物探针具有很好的特异性,能够有效扩增玛咖成分,且与其它植物均无交叉反应;芜菁引物探针虽与白菜有交叉反应,但与玛咖无交叉反应。

表3 玛咖与芜菁引物探针特异性分析结果Table 3 The result of specific amplification by primers and probes of both maca and rappini

续表

2.2 方法灵敏度

2.2.1 绝对灵敏度 将浓度为100、10、1、0.1及0.01 ng/μL的云南产玛咖(编号:YN1)及新疆产芜菁(编号:XJWJ)DNA样品分别进行实时荧光PCR扩增(图2),结果表明,当玛咖和芜菁DNA浓度在0.01 ng/μL及以上时均得到荧光扩增,空白对照(无菌水)无扩增,说明方法检测玛咖及芜菁的浓度低限均可达0.01 ng/μL。

图2 实时荧光PCR方法绝对灵敏度检测结果Fig.2 The absolute sensitivity of real-time PCR注:A:玛咖;B:芜菁；图3同。

2.2.2 相对灵敏度 采用实时荧光PCR扩增质量比分别为50%、10%、5%、1%及0.1%(w/w)的云南产玛咖(编号:YN1)及新疆产芜菁(编号:XJWJ)粉末DNA。结果表明:当玛咖粉和芜菁粉含量在0.1%(w/w)及以上时,均有典型荧光扩增曲线,空白对照(无菌水)无扩增,说明方法检测玛咖和芜菁的相对灵敏度均为0.1%(w/w)(图3)。

图3 实时荧光PCR方法相对灵敏度检测结果Fig.3 The relative sensitivity of real-time PCR methods

2.3 对市售样品的检测

提取人参玛咖片、玛咖压片糖果、玛咖粉、玛咖晶华固体饮料、玛咖人参固体饮料、黑玛咖干片及玛咖片(编号:S-1～S-7)等7份制品DNA(样品信息见表1),经植物通用引物探针扩增,均有典型的荧光扩增曲线,说明所有制品提取到质量合格的DNA(图4);采用设计的玛咖检测引物探针扩增上述制品,7份标称含有玛咖成分的制品DNA均有显著的荧光增幅,说明7份制品中均含有标识的玛咖成分(图5A);经芜菁检测引物探针扩增发现,人参玛咖片(S-1)和玛咖粉(S-3)DNA也有荧光增幅(图5B),而其它5份制品未出现荧光增幅,说明S-1和S-3两份样品中检出了未标识的芜菁成分。上述结果表明,本研究所建立的实时荧光PCR法可用于市售玛咖制品中玛咖与芜菁源性成分的鉴定。

图4 市售玛咖制品DNA提取质量实时荧光PCR检测结果Fig.4 Detection results of commercial maca products DNA quality by real-time PCR methods

图5 市售制品中玛咖与芜菁成分实时荧光PCR检测结果Fig.5 Detection results of both maca and rappini in commercial products by real-time PCR methods注:A:玛咖;B:芜菁。

3 讨论与结论

近年来,基于DNA的现代分子生物学技术克服了传统检测方法受环境、气候、加工方式等因素影响的局限性,已广泛应用在食品真伪鉴别领域。前期有文献基于普通PCR方法[10]和RPA方法[11]应用于玛咖、芜菁成分的检测。刘冬虹等[10]根据玛咖defensin基因序列设计了玛咖特异性引物,建立了玛咖及其制品中玛咖源性成分普通PCR检测方法,绝对灵敏度达0.1 ng/μL,相对灵敏度达0.1%以上,PCR扩增产物片段长度为173 bp;同时,根据芜菁H蛋白基因序列,设计了特异性检测芜菁源性成分的PCR引物,扩增产物片段长度为147 bp。该方法只需要设计特异性引物,检测成本低,适合基层实验室应用。郭燕华等[11]采用RPA技术,根据玛咖defensin序列设计了玛咖特异性引物,建立了玛咖及其制品中玛咖源性成分RPA检测方法,检测灵敏度也达0.1 ng/μL,扩增产物片段长度为186 bp。此方法可在室温环境下完成扩增反应,检测速度更快,该研究中未提及掺假物芜菁源性成分的RPA检测方法。上述两种方法操作简单、成本低,但均需要琼脂糖凝胶电泳和EB染色,相对费时费力。比较而言,本研究建立的实时荧光PCR方法更灵敏,并且无需电泳、染色步骤,避免了电泳过程中易污染问题,更适于标准化推广应用。由于玛咖制品为深加工产品,受加工过程中的机械外力、化学因素的影响,其DNA完整性较差,因此,本研究在建立玛咖、芜菁成分实时荧光PCR检测方法过程中,在保证靶标基因片段特异性的前提下,尽可能缩短了检测基因扩增长度,其中玛咖扩增片段长度为119 bp,芜菁为115 bp,两者均短于上述普通PCR法和RPA法,更利于精深加工品中玛咖、芜菁物种成分的鉴定。本研究中玛咖和芜菁的特异性引物探针均是根据defensin基因序列设计的,由于根部膨大的芜菁由白菜驯化而成,因此两者基因同源性极高,导致芜菁的特异性引物探针与白菜也有交叉反应。但目前玛咖的掺假主要是以芜菁替代玛咖而非白菜,因此芜菁与白菜的交叉反应仍能满足玛咖掺假的鉴别。

本研究针对芜菁冒充玛咖问题,根据defensin基因分别设计了玛咖、芜菁特异引物探针,建立了玛咖及其制品中两种植物成分的实时荧光PCR鉴别方法。经验证,该方法特异性好,灵敏度高,其绝对灵敏度达0.01 ng/μL,相对灵敏度达0.1%(w/w),并能准确应用于市售制品中玛咖与芜菁源性成分的检测。上述方法仍为定性检测方法,随着微滴数字PCR技术在转基因产品含量[21]以及肉制品[22]、米制品[23]等物种定量鉴别中的成功应用,后续拟开展玛咖及其掺假物芜菁的精准定量检测方法研究,以期为玛咖及其制品的真伪鉴别提供更有力的技术支撑。