二氢杨梅素改善慢性社会挫败应激小鼠认知与情感障碍*

王 乐 ，李碧蓉，肖志勇 ，赵金龙，于旭东 △

(1. 邵阳学院基础医学院，湖南 邵阳 422000；2. 南华大学附属第一医院，湖南 衡阳 421001)

负性社会经历是引起人类精神疾病的重要原因。随着生活节奏的加快，社会竞争日渐激烈，社会挫败等负性社会经历越来越常见，由此引起的抑郁、焦虑和认知障碍成为重大挑战[1]。越来越多的证据表明植物提取物在多种疾病中发挥重要作用[2-3]，二氢杨梅素(dihydromyricetin, DHM)是提取自藤茶类植物的黄酮类化合物发挥抗炎，抗氧化，抗肿瘤，护肝，调节脂质、血糖代谢及保护心血管和神经的作用[4-6]。但二氢杨梅素在认知与情感障碍中的作用却很少有人研究,尤其在社会挫败模型中的作用尚无报道。

海马内SIRT1信号在认知与情感障碍中具有重要作用，在多种啮齿类认知障碍、抑郁模型中海马SIRT1降低，并且抗抑郁药物可上调其表达[7-8]。此外，DHM可上调阿尔茨海默病大鼠SIRT1表达[9]，但DHM是否上调慢性社会挫败小鼠海马SIRT1表达尚无报道。本文基于慢性社会挫败应激(chronic social defeat stress，CSDS)诱导的认知与情感障碍模型探索二氢杨梅素能否上调SIRT1信号改善负性社会经历所引起的认知障碍、焦虑及抑郁行为。

1 材料与方法

1.1 药物

二氢杨梅素购于上海源叶生物科技有限公司(LOT：S06J6L1)，β-actin抗体 购于美国proteintech，稀释比为1∶4 000。SIRT1 抗体购于英国Abcam，稀释比为1∶1 000。

1.2 实验动物的分组与处理

雄性C57BL/6J小鼠(7周)和ICR小鼠(10周)均购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。两种小鼠饲养于标准的实验条件下：温度24℃，湿度50%，明暗周期12 h；同种小鼠配对饲养，自由饮水摄食。为使小鼠熟悉实验操作者，实验者每天抚摸小鼠，每只5 min。所有行为实验均在白天进行，实验操作遵照美国国立卫生研究院NIH的《国家实验动物健康与管理条例》。

小鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组(Control)、慢性社会挫败应激组(CSDS)和慢性社会挫败应激+DHM组(CSDS+DHM)，社会挫败应激小鼠在应激的后5 d每天下午腹腔注射DHM(分散于2% DMSO中，剂量为20 mg/kg)或2%的DMSO，药物及溶媒的注射体积为10 ml/kg。每组各14只,其中10只小鼠用来进行行为学测试,其它4只于应激结束后24 h检测海马内蛋白表达。三组小鼠在应激结束后的第1～2日进行新颖物体识别测试,应激结束后第3日进行Y迷宫测试。第4日进行社会交互和旷场测试,第5日进行强迫游泳和悬尾测试。

1.3 慢性社会挫败应激

慢性社会挫败应激基于之前的研究[10]，社会挫败在聚乙烯饲养笼中进行,饲养笼被透明隔板平均分开，孔径0.5 cm的小孔密集的分布于隔板上。在应激开始前，ICR小鼠在饲养笼的一侧饲养使其产生领地意识。应激开始时将C57BL/6J入侵鼠放入ICR攻击鼠的饲养笼中(饲养ICR攻击鼠的一侧)，停留10 min后, 将C57BL/6J小鼠放入饲养笼隔板的另一侧约24 h,在此期间C57BL/6J小鼠可看到和嗅到ICR小鼠从而进一步产生心理应激。此过程连续10 d，每天C57BL/6J小鼠需要接触不同的ICR小鼠。对照组C57BL/6J小鼠,在相同的饲养笼中配对饲养,每侧放一只小鼠。所有对照组小鼠每隔24 h更换与其配对饲养的小鼠，使其与不同的小鼠配对饲养。

1.4 行为学测试

1.4.1 新颖物体识别测试(NOR) 新颖物体识别测试基于之前的报道[11]，简而言之，小鼠分别放入隔音箱中进行习惯化(10 min)、采样(10 min)和测试(5 min)三个阶段，每个阶段相隔24 h，其中习惯化阶段为空隔音箱，采样阶段隔音箱内放入两个相同物体；测试阶段隔音箱内的两个物体随机替换一个新的识别物体。视频分析采用双盲法由熟练者进行，小鼠的鼻子距物体小于1 cm则视为探索。辨别指数(DI)=(新物体的探索时间-旧物体的探索时间)/(新物体的探索时间+旧物体的探索时间)。

1.4.2 两阶段Y型迷宫测试 Y迷宫由三个完全相同的臂(40 cm长×8cm宽×20cm高)组成，各臂夹角 120°，迷宫中央区恰好为一等边三角形(边长：8 cm)，三个臂定义为起始臂、其他臂和新颖臂。Y迷宫放置于昏暗的隔音室内，隔音室顶部一数字摄像机用于记录动物的行为。实验分为两个阶段，在第一阶段，Y迷宫新颖臂被不透明隔板隔断，将小鼠放入起始臂，使小鼠自由探索起始臂和其他臂10 min，2 h后，取掉新颖臂的隔板，并将小鼠放入起始臂，使其自由探索三臂5 min。在每只小鼠测试完成后用75%酒精擦拭迷宫内部。熟练者双盲记录5 min内小鼠进入各臂的次数及时间。

1.4.3 旷场测试(OFT) 旷场测试在黑色聚乙烯隔音箱(50 cm×50 cm×60 cm)内进行，箱底被平均分割成25个方格，其中，中央16个格子所组成的区域被定义为中央区域。小鼠穿过的格子数反应自发活动水平。小鼠进入中央区域的时间反应小鼠的焦虑样水平。测试时将小鼠依次放入测试箱内自由探索5 min。在每次动物放入前用75%酒精擦拭箱内清除遗留气味。摄像头记录测试阶段小鼠的行为，熟练者双盲统计动物穿过的格子数及在中央区域所停留的时间。

1.4.4 社会交互测试(SI) 社会交互测试采用接近回避范式,社会回避测试在一个昏暗的隔音箱中进行(40 cm×40 cm×60 cm)，在隔音箱的一侧用铁丝网围成直径为10 cm的半圆，围绕半圆形铁丝网一周的5 cm视为交互区。在第一阶段，铁丝网半圆内不放小鼠，C57BL/6J小鼠放入隔音箱中自由探索5 min，在第二阶段，ICR小鼠放入半圆形区域内，并且将C57BL/6J小鼠放入隔音箱中观察5 min内C57BL/6J小鼠在交互区所停留的时间。

1.4.5 悬尾测试(TST) 细绳通过双面胶带与小鼠尾尖固定，并悬于测试箱箱顶，持续6 min，熟练者仅分析6 min内小鼠后4 min的不动时间。小鼠停止挣扎，放弃逃离视为不动。

1.4.6 强迫游泳测试(FST) 强迫游泳实验装置为直径20 cm，高30 cm的透明有机玻璃圆筒，桶内水深15 cm，水温(23±1)℃，放置于隔音箱(800 Lx)内。实验时将小鼠放入桶内游泳6 min，每只小鼠测试结束后，更换桶内的水。通过位于箱顶的摄像头记录小鼠在测试阶段后4 min的行为表现，熟练者双盲分析小鼠的不动时间。小鼠四肢保持不动呈现漂浮状态或为保持头部露出水面的细微运动视为不动。

1.5 Western blot 检测海马组织SIRT1蛋白表达

三组小鼠每组各4只，于应激结束后24 h断头取脑剥离海马，液氮冷冻后备用。 取0.3 g 海马组织，经清洗、裂解、低温高速离心后，取上清液并用 BCA 蛋白试剂盒测定样品蛋白的浓度。电泳分离蛋白质，湿转法将蛋白转至 PVDF 膜上。转膜后，用5%脱脂牛奶封闭 2 h、加入抗 SIRT1 抗体孵育过夜，TBST 洗涤 3 次，二抗孵育 2 h，用 TBST充分洗涤后与 ECL发光底物后显色。曝光后扫描，用图像分析软件进行光密度分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 DHM改善CSDS诱导小鼠认知障碍

在新颖物体识别测试中，结果显示，各组小鼠采样阶段总探索时间无显著性差异(F(2,27)= 0.488,P>0.05,图1A)。而在测试阶段各组小鼠辨别指数DI存在显著性差异(F(2,27)=8.767,P= 0.001,图1B)。其中，CSDS组小鼠DI显著性低于Control组(P<0.01)，而CSDS+ DHM组小鼠DI显著性高于CSDS组(P<0.01)，这些结果表明DHM 改善CSDS应激诱导小鼠新颖物体识别记忆障碍。

在两阶段Y迷宫测试中，结果如图1C所示，在对照组中，小鼠在各臂停留时间存在显著性差异(F(2,27)=10.826,P<0.01,图1C左)，其中，小鼠在起始臂和其他臂的停留时间显著性低于新颖臂(P均<0.01)，表明小鼠可以识别新颖臂。在CSCD组中，小鼠在各臂停留时间无显著性差异(F(2,27)=0.32,P>0.05, 图1C中)。而在CSDS+ DHM组，小鼠在各臂停留时间存在显著性差异(F(2,27)=19.696,P<0.01, 图1C右)，其中，小鼠在起始臂和其他臂的停留时间显著性低于新颖臂(P均< 0.01)。此外，各组小鼠入臂次数无显著性差异(F(2,27)=0.067,P>0.05,图1D)。这些结果表明DHM 改善CSDS应激诱导小鼠空间记忆障碍。

A: The total time spent on exploring both objects is shown for the three groups on the sample phase; B: The discrimination index is shown for the three groups on the test phase; C: The duration of arms visits is shown for the three groups; D: The number of arms visits is shown for the three groups; CSDS: Chronic social defeat stress; DHM: Dihydromyricetin

**Pvscontrol group(vsnovel in Fig.1C);##PvsCSDS group

2.2 DHM改善CSDS诱导小鼠焦虑样行为

旷场用来测试小鼠的广泛性焦虑。结果显示，在旷场测试中各组小鼠中央区域停留时间存在显著性差异(F(2,27)=4.24,P<0.05，图2A)。其中，CSDS 组小鼠中央区域停留时间显著性低于Control组(P<0.05)，而CSDS+ DHM组小鼠中央区域停留时间显著性高于CSDS组(P<0.05)。此外,各组小鼠穿越的格子数无显著性差异(F(2,27)=0.134,P>0.05，图2B)。

社会交互测试用来测量小鼠社交焦虑，在社会交互测试中各组小鼠在第一阶段交互时间无显著性差异(F(2,27)=0.519,P>0.05，图2C)。而在第二阶段各组小鼠交互时间存在显著性差异(F(2,27)=6.199,P<0.01，图2D)。其中，CSDS组小鼠交互时间显著性低于Control组(P<0.01)，而CSDS+ DHM组小鼠交互时间显著性高于CSDS组(P<0.05)，这些结果表明DHM 改善CSDS诱导小鼠焦虑样行为。

2.3 DHM改善CSDS诱导小鼠抑郁样行为

强迫游泳测试、悬尾测试被用来评价小鼠的抑郁样水平。结果显示，在强迫游泳测试中各组小鼠不动时间存在显著性差异(F(2,27)=5.764,P< 0.01，图3A)。其中，CSDS组小鼠不动时间显著性高于Control组(P<0.05)，而CSDS+ DHM组小鼠不动时间显著性低于CSDS组(P<0.01)。在悬尾测试中各组小鼠不动时间存在显著性差异(F(2,27)=7.214,P<0.01，图3B)。其中，CSDS组小鼠不动时间显著性高于Control组(P<0.05)，而CSDS+ DHM组小鼠不动时间显著性低于CSDS组(P< 0.01)。此外，如上所述，DHM不影响小鼠自发活动水平，这些结果表明DHM 改善CSDS诱导小鼠抑郁样行为。

A: The center time is shown for the three groups in OFT; B: The number of crossing is shown for the three groups in OFT; C: The time in interaction zone is shown for the three groups in SI without target; D: The time in interaction zone is shown for the three groups in SI with target; CSDS: Chronic social defeat stress; DHM: Dihydromyricetin

*P**Pvscontrol group;#PvsCSDS group

A: The immobility time is shown for the three groups in FST; B: The immobility time is shown for the three groups in TST; CSDS: Chronic social defeat stress; DHM: Dihydromyricetin

*Pvscontrol group;##PvsCSDS group

2.4 DHM逆转CSDS诱导小鼠SIRT1蛋白表达降低

Western blot法检测小鼠海马内SIRT1的表达，结果显示，各组小鼠SIRT1蛋白表达存在显著性差异(F(2,9)=18.977,P﹤0.01，图4)。与Control组相比，CSDS组小鼠海马内SIRT1蛋白表达量显著降低(P<0.05)，而CSDS+ DHM组小鼠海马内SIRT1蛋白显著性高于CSDS组(P<0.01)。这些结果表明，二氢杨梅素改善CSDS诱导小鼠Sirt1蛋白表达降低。

CSDS: Chronic social defeat stress; DHM: Dihydromyricetin

*Pvscontrol group;##PvsCSDS group

3 讨论

负性社会经历可增加个体焦虑、抑郁、精神分裂风险及暴力、反社会行为。慢性社会挫败是一种社会从属应激。 与人类一样，在啮齿类动物试验中，慢性社会挫败可导致社会回避、快感缺失、绝望行为、焦虑行为和认知障碍[12]。与之前研究一致，当前研究显示，慢性社会挫败导致小鼠新颖物体识别测试和两阶段Y迷宫测试中记忆分数和辨别指数的降低，社会交互测试中的社会回避和旷场测试中的进入中央区域时间降低以及强迫游泳测试和悬尾测试中不动时间增加。这些结果表明社会挫败应激诱导认知障碍、焦虑样行为、抑郁样行为。

DHM慢性给药可改善低压低氧诱导大鼠水迷宫中认知功能损伤[13]以及AD模型小鼠新颖物体认知与新颖程序认知[14]。最近研究表明，DHM可改善重复束缚应激诱导小鼠NOR及Y迷宫记忆损伤[15]，当前研究应用慢性社会挫败模型进一步表明DHM慢性给药可改善社会挫败诱导小鼠新颖物体识别测试和两阶段Y迷宫测试中记忆分数和辨别指数的降低。之前研究表明，DHM不影响小鼠和大鼠的自发活动水平和新颖物体测试中两物体的总探索时间[15]。与之前研究一致，当前研究表明DHM慢性给药不影响新颖物体识别测试中小鼠穿越格子数、Y迷宫测试中的总入壁次数及NOR中采样阶段及测试阶段小鼠对两个物体的总探索时间。因此，DHM促进学习记忆并非通过影响自发活动性和自发探索行为。

DHM可改善啮齿类情感障碍，如DHM逆转LPS诱导小鼠抑郁样行为及慢性不可预测应激小鼠行为绝望和快感缺失[16]。与之前的研究一致，同时，慢性注射DHM显著性降低CSDS应激小鼠强迫游泳测试和悬尾测试中的不动时间。并且DHM不影响旷场测试中小鼠活动水平。这些结果表明DHM可改善CSCD应激小鼠抑郁样行为。 由于抑郁和焦虑的共病性[10]，我们进一步检测了DHM对CSDS小鼠社交焦虑及广泛性焦虑的作用。慢性注射DHM显著性减轻CSDS应激小鼠社会交互测试中的社交焦虑和旷场测试中的广泛性焦虑。

沉默信息调节因子 1(silent information regulator1，SIRT1) 是哺乳动物去乙酰化酶 Sirtuin 蛋白家族成员，广泛参与多种疾病的发生发展[17]，最近研究表明，SIRT1在抑郁、焦虑、认知障碍中具有重要作用。在慢性应激抑郁模型，啮齿类海马内SIRT1基因及蛋白表达显著降低[8]。与之前结果一致，当前研究表明，CSDS应激小鼠海马内SIRT1蛋白水平降低。丙米嗪、白藜芦醇等药物发挥抗抑郁作用并且上调SIRT1表达[18]。与此一致，当前结果DHM显著上调SIRT1表达。考虑到DHM可上调BDNF表达以及SIRT1可调节BDNF表达,提示SIRT1可能是DHM上调BDNF的关键信号。

综上，本研究基于社会挫败模型发现DHM可改善社会挫败应激诱导认知障碍、抑郁样行为、焦虑样行为，并且初步表明及机制可能与上调其海马组织SIRT1的表达有关。