大豆异黄酮改善母鼠抑郁样行为的作用及其雌激素受体β机制*

何凤琴，向全丽，屈庚超，周登祥

(西安文理学院生物与环境工程学院，西安市秦岭天然产物开发与抗癌类创新药物研究重点实验室，基因工程实验室，陕西 西安 710065)

绝大多数研究都是母婴分离对婴儿成年后行为的影响，然而，对于大多数的母性而言，与自己的婴儿互动是一个大有裨益和愉快的经历，可促进母婴依恋，不仅能够确保对发育中的婴儿最佳照顾，使婴儿得以健康生长，而且也能够激发母性奖赏系统，使母性产生愉悦的情绪，对生理健康产生积极效应[1]。产后抑郁症剥夺了母性与孩子一起共享天伦的乐趣，而这一疾病的发生是与女性生产之后体内性激素的变化有关。

雌激素是一种情绪调节剂，雌激素受体β (estrogen receptor β，ERβ)分布在与情绪相关的脑区，如杏仁内侧核(medial amygdaloid nucleus, MeA)，终纹床核(bed nucleus of the stria terminalis，BNST)，中视前区(medial preoptic area，mPOA)，雌激素在这些脑区通过受体对个体情绪产生重要影响[2]。大豆异黄酮(soy isoflavones)是大豆在生长发育过程中形成的一类次生代谢产物，它们的化学结构与内源性雌激素相似性，具有类雌激素作用，植物雌激素的雌激素活性取决于它们与雌激素受体α(estrogen receptor α，ERα)或β的相互作用。在一定剂量下，植物雌激素可以选择性地与ERβ相互作用，从而影响ERβ的表达[3]。一些研究认为大豆异黄酮可作为一种治疗药物用于缓解与绝经相关的生理和情绪变化，但另有一些研究认为大豆异黄酮对不同时期不同性别社会性行为影响不一致。通过对啮齿动物研究表明终生摄入大豆可导致抗焦虑作用[4]，也有研究表明，大豆异黄酮可以减少抑郁相关的行为取决于大豆异黄酮饮入开始时的年龄和卵巢状态的变化[5]。然而异黄酮类分子如何调节大脑对抑郁样行为影响机制还不清楚。本文以C57BL/6J小鼠为研究对象，通过产后母婴长期分离使母鼠发生情绪变化，通过强迫游泳(Forced swimming test ，FST) 和悬尾实验(Tail suspension test, TST)进行行为测试。通过对具有抑郁样行为母鼠食用一定时间的大豆异黄酮，探讨异黄酮类分子如何调节大脑对抑郁样行为影响的ERβ机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雌、雄C57BL/6J小鼠60只，体重28～33 g，由西安文理学院动物中心提供，购于西安交通大学医学院动物研究所。雌雄配对合笼放置于塑料鼠箱中(30 cm×20 cm×15 cm)，饲养于本实验室鼠房，保持室温 20～25℃和自然光周期 12L∶12D 。饲喂鼠饲料。饲养笼以锯木作底物，棉花作巢材，正常抚养1 d后开始实验。

1.2 材料和设备

大豆异黄酮(HPLC ≥ 98%)购自上海信裕生物科技有限公司；雌激素Elisa试剂盒(CEA461Ge)和多巴胺Elisa试剂盒(CEA851Ge)购自美国Meridian公司；一抗兔抗ERβ ( Sc28974) 购自美国Santa cruz；二抗(羊抗兔) 和SABC(链酶亲和素-过氧化物酶复合物) 购自武汉博士德生物工程有限公司，DAB 为Sigma 分装。强迫游泳和悬尾实验设备购自深圳瑞沃德生物科技有限公司，酶标仪(Bio-Tek，Winooski)购自美国，冰冻切片机(CM1950)购自德国莱卡公司，尼康显微镜及尼康相机购自日本东京。

1.3 动物分组

将产后2 d母鼠随机分为2 组，对照组(n=10)和长期分离模型组(n=40)，对照组不给予任何刺激，长期分离模型组母鼠给予从分娩第2日到第10日，母婴每天8:00-11:00分离3 h的刺激，分离后再放回鼠笼继续抚养后代。第11日通过母鼠强迫游泳和悬尾实验中挣扎的时间、频次和静止的时间、频次检测行为学指标以判断造模是否成功。

1.4 实验分组

将没有造模成功的10只母鼠排除，造模成功母鼠分成3组，加上对照组，共四组，分别是：(1)对照组(Control，n=10)：正常饮食，正常抚育后代；(2)模型组(Model，n=10)：从第12日每日早上用蒸馏水0.3 ml连续灌胃到21 d，共10 d，期间母婴不分离；(3)低浓度组(Low dose，n=10): 从第12日每日早上用15 mg/kg·d-1大豆异黄酮溶液0.3 ml连续灌胃到21 d，共10 d，期间母婴不分离；(4)高浓度组(High dose，n=10)：从第12日每日早上用30 mg/kg·d-1大豆异黄酮溶液0.3 ml连续灌胃到21 d，共10 d，期间母婴不分离。随着灌胃天数的增加，观察到高浓度组母鼠对幼鼠的抚育时间逐渐延长。灌胃24 h后，对母鼠进行行为学实验。

1.5 强迫游泳实验(forced swimming test, FST)

将母鼠放入高20 cm，直径15 cm的透明圆柱形玻璃缸中，保持水温37℃，先适应环境1 min后，再实验并记录5 min，利用smart v.3.0软件记录分析挣扎的时间、频次和静止的时间、频次。

1.6 悬尾实验(tail suspension test, TST)

将母鼠尾部固定，倒悬身体。将摄像设备放置在母鼠的正前方，先适应1 min后，再实验并记录5 min，利用smart v.3.0软件分析挣扎的时间、频次和静止的时间、频次。

1.7 Elisa测定血清雌二醇(estradiol，E2)和多巴胺(dopamine，DA)

行为实验2 d后，在8:00-10:00之间，从麻醉的母鼠眼眶后窦收集血液(戊巴比妥钠剂量为4 mg/kg体重)。血清样本在室温下以606 g的相对离心力(RCF)离心10 min将血清与血细胞分离，弃去血细胞，血清在-80℃冰箱储存。E2和DA浓度使用Elisa试剂盒测定。首先，将制备的样品和标准品分别放入板皿中，在37℃下温育30 min。其次，用洗涤溶液洗涤平板皿四次，加入辣根过氧化物酶(HRP)- 混合剂在37℃温育30 min。最后，在将培养皿洗涤四次后，培养皿浸入彩色显影剂A和B中，在37℃温育15 min后，反应被终止液停止。使用酶标仪在450 nm下测量光密度，并将空白设定为零。重复值之间的差异小于5%。

1.8 免疫组化检测部分脑区ERβ

收集血清后，由左心室注入0.1 mol PBS 150 ml，同时右心房放血，灌注4 %多聚甲醛300 ml 进行前固定，小心取脑入4 %多聚甲醛后固定3 h (4℃) ，再浸入30 %的蔗糖溶液过夜待沉底。OCT 冰冻包埋剂包埋后冰冻切片，切片厚40 μm。切片首先在正常羊血清37 ℃孵育15 min 进行封闭，然后入一抗ERβ(1∶100)，4℃孵育72 h，0.01 mol PBS冲洗3次，每次3 min，再分别于二抗和SABC 中37℃孵育30 min，0.01 mol PBS 冲洗3次，每次3 min，滴加DAB 显色剂显色10～30 min后在0.01 mol PBS中漂洗后贴片，风干，梯度酒精中脱水，封片。用0.01 mol PBS代替一抗ERβ作为阴性对照，其他实验步骤同上。

在定量分析之前，将制好的玻片随机编号，由不知实验方案的实验员分析。使用网格随机在(200×200 μm2)标准面积下采样，用眼定量数免疫反应细胞的数量。ERβ-免疫反应细胞数(ERβ-immunoreactive neurons，ERβ-IRs) 在MeA，BNST和mPOA的 200×200 μm2的区域中计算。选择这些大脑区域是因为在MeA，BNST，mPOA中发现了大量ERβ，并且与情绪活动有关[6]。根据尼氏染色和小鼠脑立体定位图集确定确定三个脑区位置[7]。

对于每个脑区，从前到后选择三个代表性切片，通过计数阳性神经元(棕黄色点状，核染色)获得每个动物的平均值。所有免疫组化过程也包括未添加一抗的阴性对照。用连接到尼康显微镜的尼康相机对选择部分进行拍摄。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 大豆异黄酮对母鼠在FST和TST中的影响

与对照组比较，模型组和低浓度组在强迫游泳和悬尾实验中，运动时间和频次明显降低(P<0.05或P<0.01)，模型组不动时间和频率明显升高(P<0.05或P<0.01)，低浓度组除了不动频次没有明显差异外(P>0.05)，不动时间也明显升高(P<0.05或P<0.01)，而高浓度组则无统计学差异(P>0.05)；与模型组比较，低浓度组除了在强迫游泳和悬尾实验中运动时间显著升高(P<0.05)，在强迫游泳不动时间显著性降低(P<0.05)，在悬尾实验中不动频次明显降低外(P< 0.01)，其他无显著性差异(P>0.05)，而高浓度组在强迫游泳和悬尾实验中运动时间和频次均明显升高(P<0.05或P< 0.01)，不动时间和频次均明显降低(P<0.05或P<0.01)；与低浓度组比较，高浓度组在强迫游泳和悬尾实验中运动时间和频次均明显升高(P<0.05或P<0.01)，在强迫游泳中不动时间明显降低(P<0.01)，其他无显著性差异(P>0.05，表1，表2) 。表明长期分离导致母鼠产生产后抑郁样行为，大豆异黄酮可减少母鼠的抑郁样行为，较高浓度的大豆异黄酮减少的更为明显。

Tab. 1 Effects of soy isoflavones on female mice in FST n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe model group;△△P<0.01vsthe low dose group

Tab. 2 Effects of soy isoflavones on female mice in TST n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe model group;△P<0.05,△△P<0.01vsthe low dose group

2.2 大豆异黄酮对母鼠血清E2和DA的影响

在ELISA实验中，与对照组比较，模型组、低浓度组和高浓度组血清中E2浓度明显降低(P<0.01)，且三组之间无显著性差异(P>0.05)；然而，大豆异黄酮可使母鼠DA的水平增加，表现为与对照组比较，模型组和低浓度组明显降低(P<0.01)，而高浓度组无明显差异(P>0.05)；与模型组和低浓度组比较，高浓度组DA水平明显增加(P<0.01)，模型组和低浓度组之间无显著性差异(P>0.05，表3)。表明具有抑郁样行为母鼠血清中雌二醇明显减少，大豆异黄酮并未使血清中雌二醇增加，较高浓度的大豆异黄酮使 DA增加明显。

2.3 大豆异黄酮对母鼠ERβ表达的影响

大豆异黄酮对ERβ-IRs有重要影响。与对照组比较，ERβ-IRs在模型组和低浓度组MeA，BNST和mPOA明显降低(P<0.05或P<0.01)，在高浓度组这三个脑区均无显著性差异(P>0.05)；与模型组比较，除低浓度组在mPOA显著性多外(P<0.05)，其他两个脑区无显著性差异(P>0.05)，高浓度组MeA，BNST和mPOA均显著多于模型组(P<0.01)；与低浓度组比较，高浓度组MeA(P<0.05)，BNST(P<0.01)和mPOA(P<0.01)均显著多于低浓度组(图1，表4)。表明具有抑郁样行为母鼠ERβ在脑区明显减少，大豆异黄酮使抑郁样行为母鼠脑区ERβ明显增加，较高浓度的大豆异黄酮使ERβ增加更明显。

GroupE2 DAControl1339.91±29.4879.76±4.63Model 800.37±259.23∗∗20.78±3.76∗∗Low dose749.37±263.56∗∗30.64±4.56∗∗High dose700.23±236.21∗∗67.83±8.23##△△

E2： Estradiol; DA: Dopamine

**P<0.01vsthe control group;##P<0.01vsthe model group;△△P<0.01vsthe low dose group

Fig. 1 Effects of soy isoflavones on the expression of ERβ in female mice(×200)

MeA: Medial amygdaloid nucleus; BNST: Bed nucleus of the stria terminalis; mPOA: Medial preoptic area

Group MeA BNST mPOAControl42.24±3.5933.57±4.2345.26±4.13Model20.36±2.6∗∗20.12±2.62∗20.31±2.15∗∗Low dose24.26±3.57∗22.24±2.42∗32.22±3.15∗∗#High dose44.57±5.12##△34.13±3.57##△△43.13±3.59##△△

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe model group;△P<0.05,△△P<0.01vsthe low dose group

3 讨论

本次研究发现具有抑郁样行为的母鼠连续灌胃10 d高浓度大豆异黄酮时，在强迫游泳和悬尾实验中活动持续时间和频次明显高于模型组，与情绪相关的脑区MeA，BNST和mPOA ERβ明显升高，血清中DA明显升高。表明母婴分离加重了产妇的负面情绪，产生较高程度的抑郁样行为，而较高浓度的大豆异黄酮能够减少抑郁样行为与大豆异黄酮使血清中DA升高，脑区ERβ增加有关，且抑郁样行为的减少与大豆异黄酮浓度有相关性。

母鼠抚育子代10 d后与子代和雄鼠长期分离，母鼠表现明显的抑郁样行为，即出现产后抑郁，与他人的研究结果相似：在大鼠，产后每天分离3 h，母鼠在强迫游泳实验中表现为抑郁样行为[8]。母婴构成不可分割二聚体[8]，母亲和同窝仔鼠构成个体社会环境的重要成分，提供如营养、热量、躯体感觉、动觉、嗅觉及听觉刺激等重要资源。母婴长期分离，不仅对幼鼠代表严重的环境剥夺[9]，同时对母鼠也是严重的环境剥夺，母鼠表现出焦虑甚至抑郁样行为，这些行为变化与控制母体行为的大脑区域的神经化学物质的改变有关，本实验就证明母鼠产生的抑郁样行为与血清中E2水平及脑区MeA，BNST和mPOA的ERβ明显下降有关，这一结果也与他人的研究结果一致：产后抑郁组雌激素下降值明显高于对照组[10]。他人和我们前期研究已经证实MeA，BNST和mPOA是调节抑郁等情绪相关的脑区[6]，E2可以和这些脑区的ERβ直接结合，发挥调整抑郁样行为的作用。给予卵巢切除的大鼠注射E2，E2可通过与脑区ERβ受体结合而发挥抗抑郁作用[11]。母子的长期分离导致E2和ERβ降低，可能与母婴分离的应激诱发的应激激素过度分泌，抑制垂体促性腺激素分泌，降低性激素合成酶活性，进而抑制卵巢产生性激素有关[10]。本研究还发现长期分离使血清中DA水平显著低于对照组，这与郦铮铮等研究结果相似[12]。DA是产生欣快感的重要神经递质，与奖赏和情绪控制有关，DA 系统参与情绪相关的调控，它是调解情绪神经回路中的关键因素[13]。雌激素可在垂体、下丘脑、黑质一纹状体和中脑边缘系统等水平影响DA 能神经递质系统的功能，从而影响神经系统对生殖和非生殖行为的控制，而对中脑边缘系统DA的调节，可能在心理障碍发生中起重要作用[14]。本次实验具有抑郁样行为的模型组E2水平下降，DA也下降进一步证实了内源性雌激素水平对中脑边缘系统DA活性的调节作用。雌激素可作用于DA 转运体上的特殊位点减少转运，也可直接或间接影响D2DA自身受体，使自身受体亲合力下降，最终抑制重摄取，减少清除率，增加DA释放量[14]。

令人感兴趣的是，虽然母鼠抚育子代10 d后与子代和雄鼠分离，但是经过连续灌胃10 d大豆异黄酮，特别是高浓度组，母鼠在悬尾实验中运动时间和频次明显高于模型组和低浓度组，尤其是在强迫游泳实验中与这两组差别极大，一方面说明大豆异黄酮可能使抑郁样行为明显减少，另一方面也可能是与大豆异黄酮对运动小鼠能量代谢具有一定的调节作用有关[15]。低和高浓度组血清中的E2比模型组降低，但无统计学意义，表明15或30 mg/kg·d-1大豆异黄酮溶液对E2有一定的抑制作用，这种趋势与刘兆平等[16]以及周志军等[17]报道的大豆异黄酮能显著增加大鼠血清中E2的研究结果相反，但与盛微等报道的相似[18]。这可能是由于大豆异黄酮是一种与E2结构相似的植物性雌激素，它能与C57BL/6J母鼠体内E2受体竞争性结合，从而反馈性调节，导致母鼠体内E2浓度降低[19]。虽然灌胃大豆异黄酮使血清中的E2比对照组降低，但MeA，BNST和mPOA ERβ明显升高，可能大豆异黄酮进入机体后与雌激素受体ERβ相结合并刺激ERβ的转录表达，从而ERβ的数量增加并调节动物的行为[20]，使抑郁样行为减少。

在本实验中我们发现连续灌胃10 d大豆异黄酮，主要是高浓度组血清中的DA也明显增多，可能与大豆异黄酮可在中枢发挥类雌激素作用，通过脑内经典的核内受体或膜甾类受体对 DA的功能活动发挥着基因组和非基因组的调节作用，使杏仁核DA能神经元释放增多[14]，对于本实验中大豆异黄酮对雌鼠 DA 释放调节的具体机制还有待于进一步的研究。