乳腺癌肿瘤组织和血浆中miR-21、miR-210的含量及临床意义

陆芸瑶 王 卉 喻 垚 李光新 吴立翔 郭变琴

乳腺癌是起源于乳腺组织的一种复杂的异质性疾病，病死率居全球癌症病死率的第5位[1]。现临床上常用乳腺钼靶X线摄影筛查乳腺癌，但频繁的筛查显著提高了疾病假阳性率(>20%)，增加了受检女性的心理负担并且其对健康女性的长期影响还未明确[2]。临床上根据癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)的含量等辅助诊断乳腺癌，但其敏感度低、特异性差，不能有效筛查早期癌症及原位癌，而且部分检测结果相同的乳腺癌患者其临床表现差异较大[3]。所以有必要研究更加敏感的诊疗因子，用以乳腺癌的早期诊断及高患病风险人群的识别。

microRNA(miRNA)是一类18～22个核苷酸组成的非编码RNA,其表达存在组织特异性、稳定性高、检测可重复性强。多个研究发现肿瘤患者组织及血浆中存在特异表达的miRNA,提示miRNA可以作为一种新的肿瘤诊疗标志物[4]。

miR-21和miR-210在胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、肠癌和卵巢癌等多种癌症中高表达,参与肿瘤的发生、发展等多个过程[5]。miR-21和miR-210在乳腺癌中的研究相对较少，对乳腺癌的诊断价值还未有明确定论。本研究通过实时荧光定量PCR方法检测miR-21和miR-210在乳腺癌组织和血浆中的含量，同时应用ROC曲线评价其在乳腺癌中的诊断价值以及通过Kaplan-Meier Plotter网站分析其与患者预后的关系,旨在探寻一种用于乳腺癌早期诊断及预后评价指标。

材料与方法

1.材料：收集2016～2017年在重庆大学附属肿瘤医院病理学确诊的乳腺癌患者肿瘤组织及血浆标本。其中，乳腺癌患者肿瘤组织标本31例，患者平均年龄52.84±8.57岁；另取癌旁组织36例作为正常对照组，平均年龄40.89±12.27岁。乳腺癌血浆样本25例，平均年龄47.36±11.72岁；另随机选取笔者医院体检健康女性血浆样本21例作为正常对照，平均年龄41.57±9.80岁。患者基本情况详见表1。本研究获得重庆大学附属肿瘤医院医学伦理学委员会批准，且所有患者均签署知情同意书。

表1 患者基本情况

2.主要试剂与仪器设备：(1)主要试剂：miRcute miRNA提取分离试剂盒、血清/血浆miRNA提取分离试剂盒、石蜡包埋组织切片miRNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，miRNA反转录试剂盒、miR-21、miR-210及内参U6的特异性茎环引物购自美国Genecopoeia公司，SYBR@PremixExTaq试剂盒购自宝生物工程有限公司。(2)仪器设备：CFX-Connect荧光定量PCR仪、T100 Thermal Cycler 梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)，NANODROP 1000核酸浓度测定仪、FRESCO17高速冷冻离心机(美国Thermo公司)。

3.研究方法：(1)miRNA提取：取新鲜冷冻的乳腺组织20～25mg，液氮中进行研磨；转移石蜡切片1～8片至离心管中；取收集的抗凝血，离心后获得上层血浆。分别参照相应miRNA提取试剂盒说明书提取miRNA，检测miRNA的A260/A280比值及浓度。(2)实时荧光定量PCR：取100ng RNA，参照miRNA反转录试剂盒进行反转录。使用SYBR@Premix Ex Taq试剂盒检测miR-21、miR-210的含量：SYBR@Premix Ex Taq 12.5μl(2×)，qPCR Forward Primer 0.5μl，qPCR Forward Primer 0.5μl，cDNA(稀释5倍) 2μl，Nuclease-free water 9.5μl。反应条件: 95℃ 10min，95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 10s，45个循环。

结 果

1.乳腺癌患者肿瘤组织中miR-21、miR-210含量：采用荧光定量PCR检测miR-21、miR-210在31例乳腺癌肿瘤组织和36例癌旁正常组织(对照组)中的含量，结果显示，与癌旁正常组织比较,miR-21在乳腺癌肿瘤组织中含量显著升高 (P=0.011，图1A)；而miR-210的含量比较差异无统计学意义(P=0.193，图1B)。

图1 乳腺癌患者肿瘤组织中miRNA的含量

2.乳腺癌患者血浆中miR-21、miR-210含量：采用荧光定量PCR检测miR-21、miR-210在25例乳腺癌患者血浆和21例健康者血浆(对照组)的含量。结果显示，与对照组比较,miR-21、miR-210在乳腺癌患者血浆中的含量差异无统计学意义(P=0.874，P=0.457，图2)。

图2 乳腺癌患者血浆中miRNA的含量

3.miR-21诊断乳腺癌的ROC曲线：绘制ROC曲线, 评价miR-21在乳腺癌中的诊断价值, ROC曲线下面积趋近于1, 该指标对疾病的预测价值越高。miR-21的AUC=0.695(图3), miR-21在乳腺癌的诊断中具有一定的作用。

图3 组织miRNA-21辅助诊断乳腺癌的ROC曲线

4.miR-21的含量与乳腺癌患者生存曲线分析：通过Kaplan-Meier Plotter网站分析miR-21与乳腺癌患者预后的关系。结果显示，miR-21高含量组生存时间明显低于miR-21低含量组，经log-rank检验，两组间比较，差异有统计学意义(P=0.019)。

图4 乳腺癌患者miR-21含量-生存曲线

讨 论

乳腺癌是全球女性癌症患者中最常见的癌症，每年全球的新增病例超过100万例。乳腺癌导致的女性病死率居癌症相关病死率的第2位[6,7]。所以研究更加敏感的乳腺癌早期诊断肿瘤标志物显得尤为重要。miRNA可以作为诊断标志物的基础是miRNA在患病组织及血液中存在特异的稳定的表达。

miRNA-21在多个实体瘤(前列腺癌、直肠癌、肺癌等)中的表达均上调，参与多个肿瘤抑制基因(PTEN、PDCD4、p53等)的调控，与肿瘤细胞的生长、入侵和转移等有关[2]。在乳腺癌中，miR-21参与癌细胞的增殖与转移[8]。有研究报道miR-21在乳腺癌患者组织中表达上调， miR-21 的含量和激素水平及疾病分期、淋巴结转移、远端转移、ROC曲线等相关[2]。另有研究报道血浆中miR-21的含量和激素水平及疾病分期无关[9]。笔者研究发现，乳腺癌患者肿瘤组织中miR-21的含量显著高于对照组，而血浆中miR-21的含量与对照组比较差异无统计学意义。笔者实验结果表明组织中miR-21可作为乳腺癌诊断肿瘤标志物, 后续仍需大量的标本进行验证。为了进一步研究miR-21对乳腺癌的诊断价值，笔者进行了ROC曲线分析，AUC作为评价指标，AUC越大说明诊断效果更好。ROC曲线下面积为0.695，表明组织中miR-21的含量可作为乳腺癌诊断有效指标。另外，笔者还使用Kaplan-Meier Plotter网站分析了miR-21的生存曲线，发现miR-21高含量组生存时间明显少于miR-21低含量组，说明miR-21含量的高低和乳腺癌预后相关。

有研究表明，miR-210在乳腺癌患者血浆中含量升高,笔者实验结果表明乳腺癌肿瘤组织、血浆中miR-210的含量与对照组比较差异无统计学意义, miR-210在肿瘤组织与血浆结果相一致,均未升高[5]。与文献报道不一致的原因可能为各实验室标本采集及实验技术流程的不同造成结果的差异, 因为不同的标本会影响miRNA的表达，如标本的种族差异、标本量、对照组的选择等, 对于血浆标本而言，抗凝剂的不同、新鲜血液标本还是冻存血液标本、标本是否存在肉眼不可见的溶血、脂血等也会影响miRNA的表达。不同的实验技术同样会影响miRNA的表达，如miRNA提取方式、内参的选择、检测方法的不同, 离心的转速、RNA浓度的检测这些都会影响miRNA的表达[10，11]。

此外, 由于肿瘤患者血浆中的miRNA主要来源于肿瘤细胞的凋亡，应激、炎症及迁移等导致的肿瘤细胞损伤后miRNA的释放, 不同病理状态下，miRNA被选择性地释放到血浆中, 因此标本采集的时间点对于结果的影响非常大[12，13]。另有研究报道，miRNA不仅可作为癌症的血浆肿瘤标志物，也可以作为其他疾病的标志物 (如miR-21 、miR-210在肠炎、溃疡、心血管系统疾病、肝脏疾病、糖尿病等疾病中存在差异表达), 收集单纯患有乳腺癌的标本难度极大[14]。以往的研究包括笔者的研究中收集的患者大多患有一些心血管系统、糖尿病等疾病, 这些不同的疾病状态可能会影响miR-21、miR-210在血浆中的表达。miRNA的表达也极易受到患者饮食习惯、生活方式等的影响，即使一个小小的静脉穿刺也有可能影响其表达[11，15]。

总之, 由于血浆中miRNA的含量受多因素影响， 因此选取血浆miRNA作为肿瘤标志物还需要制定统一的标准实验流程, 如:样本收集、处理、检测方法的选择、参考区间的确定等。多个miRNA联合检测比单个miRNA检测更敏感，选择哪些miRNA作为生物学标志物需要开展大量实验研究进行验证。