不同方法学检测急性髓系白血病MPO阳性率的比较及意义

郑 瑞 章 鸯 陈葆国 沈芝颖 林爱芬

白血病的精准诊断需要多学科(形态学、免疫学、遗传学和分子生物学)的综合诊断。目前骨髓细胞涂片形态学仍是基础，形态学对急性髓系白血病(AML)的分型主要依据1986年的FAB(French-American-Britain)的分型标准。组织化学染色辅助用于白血病的形态学分型，其中髓过氧化物酶(MPO)染色是鉴别髓系白血病的关键指标。实际工作中，笔者发现部分AML患者骨髓病理切片、细胞涂片及流式细胞学检测白血病细胞胞内MPO活性的结果并不一致，本研究通过对这3种方法检测AML胞内MPO的结果进行比较，探讨三者之间的优缺点及临床意义。

资料与方法

1.一般资料： 对笔者医院2012年5月～2016年3月初诊AML，且均进行骨髓活检、免疫学分型及骨髓形态学检查的患者，共计90例，其中男性58例，女性37例，患者年龄1～93岁，中位年龄60.5岁，按FAB分型，详见表1。

2.检测方法： (1)骨髓活检标本MPO染色：①Bouin氏固定液固定过夜；②放入EDTA脱钙液脱钙4～5h；③流水冲洗15min，投入脱水机，常规脱水、透明，石蜡包埋切片3μm；④MPO染色：72℃烤片1h，二甲苯脱蜡2缸(10分钟/每缸)，梯度乙醇脱水(梯度乙醇100%、95%、75%，2分钟/每次)，PBS洗5次，高压修复，PBS洗5次，3%双氧水室温孵育10min，PBS洗5次，加兔抗人MPO多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)37℃ 1h，PBS洗5次，二抗37℃ 20min、三抗各10min，DAB显色5～10min，苏木精复染2min，自来水冲洗，盐酸酒精分化，逐级梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。中性粒细胞作内对照或阳性标本做阳性对照，用PBS做阴性对照，低倍镜或高倍镜判断，MPO+或MPO少量+均按阳性统计。(2)骨髓涂片MPO染色 ：采用联苯胺法染色，方法按试剂盒(上海太阳生物技术有限公司)说明书进行：新鲜骨髓涂片滴加Ι液(含联苯胺等)数滴覆盖血膜，室温放置1min，滴加Ⅱ液(含过氧化氢)数滴，混匀后室温放置5min,流水冲洗，滴加95%乙醇脱色，流水冲洗后瑞士-吉姆萨复染。阳性颗粒呈棕黄或蓝黑色，颗粒阳性的原始细胞(包括幼稚单核细胞)>3%为MPO表达阳性。(3)流式细胞术检测胞内MPO ：抽取骨髓液1.5ml，枸橼酸钠抗凝，取2支试管，两管均加入10μl CD45-PerCP-Cy5.5单抗与50μl EDTA抗凝骨髓液[(1～2)×106个细胞]组合，避光15min。加溶血素2ml避光15min。300×g离心10min ，去上清，加2ml PBS洗一次，弃上清，每管加入100μl固定液(MEDIUM A)(杭州联科生物技术股份有限公司)，室温孵育15min，加入2ml PBS洗1次，弃上清，每管加入100μl破膜剂(MEDIUM B)(杭州联科生物技术股份有限公司)，第1管加入IgG1-FITC及IgG1-APC同型抗体各10μl，第2管加MPO-FITC单抗(美国BD公司)10μl及CD3-APC单抗5μl，室温孵育30min，加入2ml PBS洗1次，弃上清，每管加1%多聚甲醛0.5ml，BD FACS cantoⅡ流式细胞仪获取，数据用FACS Diva软件分析，阳性MPO表达的原始细胞(包括幼稚单核细胞)>10%为MPO表达阳性。

3.统计学方法 ：所有数据采用SPSS 24.0统计学软件对数据进行统计分析，计数资料多组之间的比较采用χ2检验，组间比较采用Bonferroni方法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.AML患者MPO总体表达分析：AML患者共90例，MPO表达阴性仅见4例，3种方法联合检测MPO表达阳性率为95.5%。除AML-M7亚型均呈MPO阴性表达外，MPO阴性患者仅出现在AML-M5亚型(表1)。

表1 AML患者FAB分型及MPO阳性率

2.3种方法检测AML患者MPO阳性率的比较：90例AML患者骨髓活检组织、骨髓涂片及骨髓液标本MPO阳性率分别是66.7%(60/90)、93.3%(84/90)及87.8%(79/90)(表1)，阳性率明显不同，差异有统计学意义(χ2=24.782,P=0.000)。其中，免疫组织化学方法检测MPO阳性率显著低于骨髓涂片细胞化学法和流式细胞学方法(P<0.05)，而细胞化学法和流式细胞术检测MPO阳性率比较,差异无统计学意义(P<0.05)。

3.AML-M5患者MPO表达：除M7(急性巨核细胞白血病外)，MPO共阴性的标本只见于M5患者中，因此，为比较3种方法对原始幼稚单核细胞MPO表达的敏感度，对27例M5患者的MPO表达分析，免疫组化阳性率为37%(10/27)明显低于细胞化学法(88.9%，24/27)，差异有统计学意义(P<0.05)，免疫组化法低于流式细胞学方法(63.0%，17/27)，但差异无统计学意义(P>0.05)，而细胞化学和流式细胞术检测MPO结果比较，差异无统计学意义 (P>0.05)。以其中1例M5b患者为例，组化显示原始及幼稚单核细胞MPO(-)，但骨髓涂片原始及幼稚单核细胞胞质内可见明显MPO阳性颗粒，免疫学分型显示MPO阳性率占14.2%(图1)。

图1 1例AML-M5b患者酶免疫组织化学、细胞化学及流式细胞学MPO检测结果比较

讨 论

多参数流式细胞学的应用使白血病的免疫学分型更为精确，但MPO仍然是FAB及WHO分型鉴定AML或者急性非淋巴细胞白血病(ANLL)关键的参考指标[1]。流式细胞学、免疫组织化学及细胞化学3种方法，任何一种能检测到白血病细胞MPO表达阳性的结果，都可以认为其具髓系分化特征[2]。上述3种检测方法相互补充，本研究对90例AML患者的MPO进行检测，均为阴性结果的标本仅为4例，其中包含1例M7患者，可见通过多种方法对急性白血病骨髓标本MPO的检测可以鉴定绝大多数急性非淋巴细胞白血病，然而在AML的实验室诊断实际过程中，上述3种检测时间并不同步，MPO检测结果并非完全一致。因此本研究回顾分析了笔者医院部分初诊AML患者MPO表达情况，对上述3种检测结果进行比较和分析，以利于临床医生对检测报告更好的解读。

本研究数据表明3种方法对MPO检测，结果明显不一致，差异有统计学意义。其中，活检组织MPO阳性率最低，显著少于细胞化学及流式细胞学方法检测MPO的阳性率(P均<0.05)，细胞化学与流式细胞学两者检测MPO阳性率最接近(P>0.05)。从FAB分型中各类AML细胞MPO阳性率看，除M0和M7之外，AML-M5患者的MPO阳性率各种方法检测均最低，各组间差异亦明显，而以组织化学方法检测MPO阳性率最低，与细胞化学之间的差异最明显。相对而言，细胞化学法或流式细胞学方法检测AML患者MPO敏感度更高。对于多克隆抗体检测活检组织白血病细胞MPO敏感度低于细胞化学法和流式细胞学方法的原因，笔者认为，可能在于原始及幼稚单核细胞本身低表达MPO，病理免疫组化涂片对弱或极弱表达的MPO不易分辨，而油镜下对骨髓涂片MPO阳性颗粒较少的细胞更容易辨认，流式细胞术MPO单克隆抗体检测通过设门分析有能够排除背景细胞干扰的优势。三者检测原理的区别在于联苯胺法是对MPO酶活性的鉴定，而多克隆抗体方法对骨髓活检组织切片或单克隆抗体流式细胞术等免疫学方法检测胞内MPO，只能反映MPO是否存在，不能反映酶的活性。这样，理论上会存在对部分患者用3种方法检测MPO结果不一致的现象[3]。

本研究AML-M0患者共2例，虽然活检组织及细胞涂片MPO阴性反应，但流式细胞术显示2例均表达MPO蛋白，足见流式细胞术在白血病分型中的优势，这或许因为本研究2例M0患者仅存在MPO前体蛋白，而无酶活性有关[3]。除外电子显微镜检测技术，免疫学方法较细胞化学方法更敏感[4]。除AML-M0外，本研究细胞化学染色法与流式细胞学方法检测MPO相比较，结果较一致，与文献报告结果相似[5，6]。此外，本研究两例AML-M5a患者细胞化学检测MPO阳性而流式细胞术未检出，或许和两者阳性率判断标准有关，大样本资料更有利于统计学分析。

总之，本研究显示不同的MPO检测方法，AML患者MPO阳性检出率不尽相同，流式细胞术对AML-M0的诊断有不可替代的优势，细胞化学染色对AML-M5患者MPO的敏感度优于流式细胞术，三者结合可以显著提高AML患者MPO的检出率，比单独一种方法更有助于急性白血病的准确分型。