淫羊藿苷通过Wnt/β-catenin信号通路对卵巢癌细胞CAOV3增殖的影响

陈 茹 苏 莹 柳 江

在妇科恶性肿瘤中，卵巢癌属于高发类型，在全球范围内，卵巢癌在女性癌症病死率中占第15位[1]。近年来卵巢癌的发生率呈逐年升高的趋势，并且其具有病程发展迅速，病死率高的特点。由于卵巢癌在早期没有典型的临床病症、肿瘤细胞增殖速度迅速及恶化程度极高、没有准确性较高的肿瘤标志物等有效的筛查手段等原因，在确诊卵巢癌时已经有约70%的病例处于晚期[2]。目前，临床上对于卵巢癌的治疗手段多数以手术为主化疗为辅，但治疗效果仍然不容乐观[3]。

Wnt属于分泌性糖蛋白家族，是调控细胞增殖、细胞分化、细胞迁移及细胞极性的关键信号分子。当Wnt信号通路发生异常调节时，可引起免疫机制的失衡，并参与肿瘤的发生、发展[4]。β-catenin属于一种多功能胞质蛋白，在Wnt信号通路中起到重要作用，不仅是Wnt信号转导通路的关键调控点，还是上皮钙黏素复合体的主要成分[5～7]。在生理状态下，胞质内的大部分β-catenin参与细胞黏附，而当Wnt信号通路激活后可抑制β-catenin的降解及磷酸化，使得多余的β-catenin与核内的转录因子结合，启动与细胞增殖有关的基因发生转录[8～10]。因此，Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。

淫羊藿含有多种药理活性成分，除了一些必需微量元素外，主要含有生物碱、黄酮类等化合物。中药淫羊藿具有多种药理活性，如增强性腺功能、提高机体免疫力、抗氧化延缓衰老等作用，其中淫羊藿苷(icariin)属黄酮类化合物，是淫羊藿的主要活性成分之一[11]。有研究报道证实，淫羊藿苷可抑制肿瘤细胞增殖及恶化，诱导癌细胞凋亡，但关于淫羊藿苷对卵巢癌的研究报道较为少见[12]。

本实验旨在研究淫羊藿苷对人卵巢癌细胞CAOV3生长抑制及过程中可能的相关机制，为淫羊藿苷在临床上对卵巢癌的治疗奠定基础。

资料与方法

1.材料和试剂: 淫羊藿苷、MTT(Sigma，Saint Louis，MO，USA)；人卵巢癌细胞CAOV3(中国科学院细胞库，上海，中国)；GAPDH、β-catenin、c-myc和cyclinD1人一抗、HRP标记二抗(武汉三鹰生物技术有限公司，武汉，中国)；DMEM(Gibco，Carlsbad，CA，USA)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光实时定量PCR(RT-PCR)试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，引物合成(TaKaRa，大连，中国)；BCA蛋白定量试剂盒、细胞裂解液(碧云天生物技术研究所，南通市，中国)。

2.细胞培养:人卵巢癌细胞CAOV3在37℃、5%CO2的条件下孵箱中培养，培养细胞数量达85%融合时，胰酶消化处理后，用DMEM(含10%胎牛血清)培养基稀释细胞悬液，将细胞目的浓度调整为2×108/L，计数后接种于对应的培养板中，备后续实验使用。

3.检测细胞增殖抑制率:淫羊藿苷处理细胞后MTT比色测定细胞增殖能力：将细胞CAOV3接种于96孔板中，浓度为1×105/ml，每孔100μl。24h 后加入淫羊藿苷(终浓度分别为10、20、40、60、80μg/ml)，每个浓度重复5个孔，独立重复6次，对照组不给药。在37℃、5%CO2的条件下培养孵育24、48 及72h，换去药液。每孔加入10μl的MTT，浓度为5mg/ml，4h后，通过酶标仪检测各孔570 nm波长的吸光度(A)值。按以下公式计算细胞抑制率：抑制率(%)=(正常对照组A值-实验组A值/正常对照组A值)×100%。

4.细胞形态学观察:将人卵巢癌细胞CAOV3培养好后，分别用含0、20、40和60μg/ml淫羊藿苷的培养液，在37℃、5%CO2的条件下培养24h，各组用倒置显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)观察并拍摄细胞形态变化。

5.RT-PCR检测β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA的表达:将培养好的细胞接种于6孔板，104个细胞/孔，24h后吸去上清液，分别用含0、20、40和60μg/ml淫羊藿苷的培养液培养24h后，收集各组细胞，依照RNA提取试剂盒说明书中的方法提取待检组织中的总RNA，采用紫外可见分光光度计(日本Hitachi公司)检测总RNA的浓度和纯度(A260/A280>1.8为合格)。然后按照反转录试剂盒说明书方法进行反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，按照RT-PCR试剂盒说明书方法检测β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA的表达。引物序列如表1所示，反应条件为：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，扩增40个循环。从仪器软件中输出Ct值，计算相对表达量采用2-△Ct方法，按照下列公式计算：△Ct(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(对照基因)。

表1 RT-PCR引物序列

6.Western blot法检测β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白的表达: 将培养好的细胞接种于6孔板，104个细胞/孔，24h后吸去上清液，分别用含0、20、40和60μg/ml淫羊藿苷的培养液培养24h后，收集各组

细胞，用细胞裂解液裂解细胞，高速离心机低温离心15min，收集上清。用BCA试剂盒测定提取蛋白浓度，取50μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，将分离的蛋白电转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭1h，加入一抗孵育(1∶1000)，4℃过夜。TTBS充分洗膜后，加入二抗(1∶2000)室温孵育1h，ECL暗室显影，凝胶成像仪(Bio-Rad Laboratories，California，USA)扫描纪录，以GADPH作为内参，进行灰度分析比较。

结 果

1.淫羊藿苷对CAOV3细胞增殖抑制的影响:分别用含0、10、20、40、60、80μg/ml淫羊藿苷的培养液培养24、48、72h后，各组中均可显著抑制CAOV3细胞的增殖，随着浓度和时间的增加，增殖抑制率明显升高(P<0.01)，并呈现出明显的剂量依赖性。详见表2。在本研究的后续实验中选取20、40、60μg/ml淫羊藿苷作为给药浓度，作用时间为24h。

表2 不同浓度淫羊藿苷对CAOV3细胞的增殖抑制作用

2.淫羊藿苷对CAOV3细胞形态的影响:如图1所示，与对照组比较，分别用含20、40、60μg/ml淫羊藿苷的培养液培养24h后，各组中细胞形态明显改变，细胞皱缩，贴壁不牢，增殖细胞数明显得到抑制，并且具有明显的剂量依赖性。

图1 不同浓度的淫羊藿苷处理24h后，倒置显微镜下观察淫羊藿苷对CAOV3细胞形态的影响

3.淫羊藿苷对β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA水平的影响:如图2所示，分别用含20、40、60μg/ml淫羊藿苷的培养液培养24h后，与对照组比较，各组中cyclinD1 mRNA 表达量、c-myc和cyclinD1 mRNA水平均被显著抑制(P<0.01)。

图2 RT-PCR检测淫羊藿苷对CAOV3细胞β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA的表达水平的影响

4.淫羊藿苷对β-catenin、c-myc和cyclinD1 蛋白表达水平的影响:分别用含20、40、60μg/ml淫羊藿苷的培养液培养24h后，与对照组比较，各组中β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白表达水平也被显著抑制 (P<0.01)，且具有一定的浓度依赖性(图3)。

图3 Western blot法检测淫羊藿苷对CAOV3细胞β-catenin、c-myc和cyclinD1的蛋白结果

讨 论

卵巢癌以其恶化程度高，病情进展迅速为特点，是病死率较高的妇科恶性肿瘤，而早期缺乏有效的筛查手段以及长期有效的治疗方案的缺乏是卵巢癌病死率居高不下的原因。因此，寻找新的有效的治疗方法一直以来都是卵巢癌研究领域的热点。

β-catenin作为一种细胞间的黏附分子，当其存在于细胞膜上时有参与细胞黏附的功能，一旦发生细胞核的转位或被降解，黏附活性则消失[13]。有研究表明β-catenin不仅有介导细胞黏附的功能，还具有信号转导作用，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活是人类肿瘤发生的重要机制之一，β-catenin的过度表达也是此信号通路激活的主要表现[14]。原癌基因cyclinD1和c-myc，在细胞的增生、分化与凋亡过程中起到重要作用，并且与多种肿瘤发生、发展有关。近年来研究显示，cyclinD1、c-myc在Wnt信号通路中是非常重要的靶基因，免疫组化研究证实在多种肿瘤中cyclinD1、c-myc、β-catenin的异常表达和Wnt信号通路激活有关，Wnt信号途径激活时，进入细胞核的β-catenin增加，进一步活化cyclinD1和c-myc等基因的表达，促进细胞增殖[15，16]。在细胞核内，如果β-catenin异常蓄积并活化基因时，β-catenin基因就成了癌基因，已有研究证明β-catenin与多种消化系统、血液系统、生殖系统的肿瘤发生有关[17]。

本实验中在卵巢癌细胞CAOV3中分别加入不同终浓度的淫羊藿苷，24、48及72h后检测指标。MTT检测结果显示，与对照组比较，淫羊藿苷能显著抑制细胞CAOV3的活性，随着浓度和时间的增加，增殖抑制率明显升高，并呈现出明显的浓度依赖性。淫羊藿为一种常见中药，具有免疫调节、延缓衰老等作用，在大量肝癌、乳腺癌等疾病的研究中淫羊藿苷有明显的抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡的作用[18，19]。目前，对淫羊藿苷抑制卵巢癌细胞CAOV3增殖的作用机制尚未完全明确，推测可能是通过改变CAOV3细胞膜生化特性、使其细胞周期相的S期减小，影响其生理活动和物质代谢进而抑制CAOV3细胞生长。国外有相关研究表明淫羊藿苷可明显调节影响肺癌恶性增殖的JAK2/STAT3信号通路的活性[20]。结合本研究结果，证明淫羊藿苷在体外具有抑制CAOV3细胞增殖的作用。倒置显微镜下发现淫羊藿苷处理以后，增殖的CAOV3细胞数目减少，形态发生明显变化，细胞逐渐皱缩，从细胞形态学上进一步证明淫羊藿苷在体外具有明显抑制CAOV3细胞生长的作用。分析其原因，可能是随着淫羊藿苷浓度的增加及药效的深入，抑制CAOV3细胞增殖的效果增强，加剧CAOV3细胞的凋亡，明显降低其迁徙能力，因而在形态学上表现出明显的细胞逐渐皱缩并数目减少。

RT-PCR检测结果表明，淫羊藿苷可降低β-catenin mRNA的表达以及抑制Wnt信号通路靶基因c-myc和cyclinD1 mRNA的表达，分析原因可能为cyclinD1为特异性周期蛋白，在正常细胞的增殖和生长过程中起着主要作用，其过度表达是多种原发性恶性肿瘤的特征；c-myc是myc基因家族的重要成员之一，是一种可使细胞无限增殖、促进细胞分裂的基因，其低表达，能使细胞生长停滞、促进细胞分化。cyclinD1和c-myc在Wnt信号通路中起着核心作用，两者共同影响肿瘤疾病的进展，β-catenin基因则主要通过激活cyclinD1而参与肿瘤的发生。

淫羊藿苷对细胞周期有特异的阻断作用，能干扰和抑制DNA的复制与合成，杀伤处于增殖期的细胞。因此，淫羊藿苷抑制癌细胞增殖的作用可能是通过抑制β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA水平的表达。Utsuki等[21]对患者肿瘤组织中cyclinD1和β-catenin的表达水平进行分析发现，随着肿瘤的恶化，cyclinD1和β-catenin的mRNA表达水平逐渐升高。此外，还有研究发现，肾母细胞瘤细胞中β-catenin、cyclinD1和c-myc mRNA的阳性表达率较正常肾组织明显升高，说明β-catenin、cyclinD1和c-myc mRNA的高表达在肾母细胞瘤形成中可能起着重要作用[22]。其研究结论与本研究相结合能够更好的说明淫羊藿苷的作用机制是通过降低β-catenin、cyclinD1和c-myc的表达，并且Western blot法检测结果同时也表明淫羊藿苷可下调β-catenin、c-myc和cyclinD1的蛋白表达。表明淫羊藿苷能够下调β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白，使其不能与核内的转录因子结合，进而影响细胞的增殖。Li等[23]研究表明，淫羊藿苷能够通过作用于microRNA-21进而影响PTEN、RECK和Bcl-2蛋白的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞发生凋亡。本研究发现淫羊藿苷抗肿瘤的新的作用机制，即通过降低β-catenin、c-myc和cyclinD1的表达，产生抑制肿瘤细胞增殖的作用。本实验结果可为淫羊藿苷对卵巢癌的药物治疗作用提供一定的理论基础。

综上所述，本研究证明淫羊藿苷可以抑制人卵巢癌CAOV3细胞株的增殖，其作用机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来实现的。