5-脂氧合酶抑制剂Zileuton缓解压力负荷诱导的心肌重构

邓 伟 陈娇娇 魏 丽 吴青青 唐其柱

心肌重构是高血压病、冠心病、瓣膜病等多种心血管疾病发展为心力衰竭的关键病理生理过程。虽然现在对心力衰竭的治疗由改善血流动力学(强心利尿)进展到系统治疗(抑制神经内分泌过度激活，以及心脏再同步化辅助装置等)，但心力衰竭的发生率和病死率仍居高不下[1]。《中国心力衰竭诊断与治疗指南2014》明确指出，心力衰竭的治疗目标不仅是改善症状，提高生活质量，更重要的是针对心肌重构的机制，防止和延缓心肌重构的发展，从而降低心力衰竭的病死率和住院率。因此，在目前各种治疗策略已达到瓶颈的现状下，探索新的、可能更有效的心肌重构干预靶点，进而遏制心力衰竭的发生、发展，显得尤为迫切。

炎性因子及免疫信号通路在心肌重构中发挥了重要作用，但白三烯及其相关通路蛋白是否在心肌重构中发挥了作用尚不清楚。5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase, 5-LOX)是机体白三烯合成的关键酶，它通过经典的免疫调控效应在肿瘤、感染性疾病、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等多种疾病进展中发挥了重要作用[2～5]。既往对5-LOX在心血管疾病中的作用研究集中在动脉粥样硬化和冠心病，但5-LOX对压力负荷诱导心肌重构的影响国内外尚无报道[6, 7]。在本研究中，笔者应用5-LOX抑制剂Zileuton干预压力负荷诱导的小鼠心肌重构，拟探讨Zileuton对心肌重构和心力衰竭的作用。

对象与方法

1.实验动物及分组:C57BL/6J(C57)品系的野生型小鼠，购于中国医学科学院实验动物研究所，选择体重24～27g、8～10周龄的雄性小鼠为实验对象，建立心肌重构小鼠模型，进行观察和研究。小鼠饲养于独立送回风净化笼具(IVC)内，自由进食进水，饮用水经高压处理，饲料经60Co照射灭菌。系统环境为SPF级，温度维持在22～24℃，湿度为50%～60%，12h明暗交替。实验分4组：假手术组(Sham组)包括对照组(Sham-Veh组)和Zileuton干预组(Sham-Zil组)，心肌重构模型组(AB组)也包括对照组(AB-Veh组)和Zileuton干预组(AB-Zil组),每组20只小鼠。

2.心肌重构动物模型制作及干预方法:制作压力负荷性左心室心肌重构小鼠模型(AB模型组)：经戊巴比妥钠麻醉小鼠，沿第2～3肋间水平切开皮肤，依次分离肌肉及软组织，游离胸主动脉，将7-0手术缝线穿过主动脉，将去尖的27号针头连同主动脉一起结扎，然后立即抽出针头，造成主动脉70% 狭窄后，逐层缝合切口。假手术组只在分离主动脉后穿过一条短丝线，不作结扎，其他手术步骤同模型组。

Zileuton购自南京康满林生物科技有限公司，纯度98%，每次使用前用0.5%羧甲基纤维素溶液制成新鲜悬液。药物干预组Zileuton 70mg/kg灌胃，每天1次，术后1周开始，持续至术后7周取材，对照组同时给予等容量溶媒灌胃。

3.心脏超声检测:术后8周做心脏超声检测。异氟烷吸入性麻醉小鼠，将小鼠左胸前区剃毛，涂抹耦合剂，取左侧卧位或仰卧位对小鼠行超声检查。采用高频超声诊断仪(My lab 30，意大利Esaote公司), 频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量小鼠心率(HR)、舒张末期左心室内径(LVEDD)、左心室后壁厚度(LVPWD)、室间隔厚度(IVSD)、射血分数(EF)。每组小鼠采集10只小鼠的数据。

4.组织病理学检测：术后8周取材。取出心脏和肺脏，用滤纸吸干血液后分别称重，计算心脏重量与体重的比值(HW/BW)，肺脏重量与体重的比值(LW/BW)。每组各取8个心脏加入10倍量4%多聚甲醛固定后24h后, 将小鼠心脏放于翻拍板上用照相机(尼康D700)拍大体心脏。将拍完后的心脏脱水、石蜡包埋、切片。其中部分组织切片(n=8)留作心肌胶原天狼星红染色；另一部分组织切片进行常规HE染色(n=8)。

结 果

1.Zileuton抑制了压力负荷诱导的小鼠心肌重构和心功能下降:超声结果显示，Zileuton干预使AB-Zil组小鼠射血分数(EF)下降程度较AB-Veh组明显缓解，并抑制了舒张末期室间隔厚度(IVSd)和左心室后壁厚度(LVPWd)的增加，同时使左心室舒张末内径(LVDd)缩小，改善了由压力负荷诱导的心肌重构和心功能下降(图1，图2)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组小鼠心脏超声影像比较

图2 Zileuton干预对压力负荷诱导小鼠左心室结构和心功能改变的影响与Sham-Veh组小鼠比较，*P<0.05；与AB-Veh组小鼠比较，#P<0.05；n=10

2.Zileuton改善了压力负荷诱导的小鼠心肌细胞肥大和心肌纤维化:取材结果显示，Zileuton干预的心肌重构模型组(AB-Zil组)小鼠心重、肺重、心重/体重比，肺重/体重比均较对照组(AB-Veh组)小鼠减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。同时各组小鼠体重没有明显差异(图3)。病理学检测显示，Zileuton明显缓解了压力负荷诱导的心肌重构，包括心肌细胞肥大和心肌纤维化(图4)。

图3 Zileuton干预对压力负荷诱导小鼠心重和肺重变化的影响与Sham-Veh组小鼠比较，*P<0.05；与AB-Veh组小鼠比较，#P<0.05；n=15

图4 病理学大体观察以及左心室HE染色(×400)和天狼星红染色(×200)结果与Sham-Veh组小鼠比较，*P<0.05；与AB-Veh组小鼠比较，#P<0.05；n=8

讨 论

在本项研究中，笔者发现，5-LOX特异性抑制剂Zileuton能够抑制压力负荷诱导的小鼠心肌重构和心功能下降，包括改善射血分数，使舒张末期左心室扩大程度减少，缓解了舒张末期室间隔和左心室后壁的增厚。Zileuton对心肌重构的抑制作用通过取材结果得到进一步证实，Zileuton干预组小鼠心重、肺重、心重/体重比、肺重/体重比均较对照组小鼠减轻。心肌HE染色和天狼星红染色也显示Zileuton使单个心肌细胞横截面积和心肌组织胶原沉积的增加均被抑制。

5-LOX属于氧化还原酶，是一种含非血红素铁的蛋白质，其经典作用是白三烯(leukotrienes，LTs)合成的限速酶[4]。细胞膜磷脂在磷脂酶的作用下生成花生四烯酸(arachidonic acid, AA)，5-LOX催化花生四烯酸氧化生成不稳定的中间产物5-羟基二十碳四烯酸(5-hydroxyeicosate-traenoic acid，5-HETE)；随后，5-HETE继续在5-LOX催化下，生成 LTA4；不稳定的LTA4在LTA4水解酶作用下形成LTB4(leukotriene B4，LTB4)，在LTC4合成酶作用下形成白三烯C4(leukotriene C4，LTC4)，LTC4被主动转运出细胞后，在α-谷氨酰转肽酶的作用下转化为白三烯D4(1eukotriene D4，LTD4)，LTD4再进一步代谢为白三烯E4(1eukotriene E4，LTE4)[8]。LTB4、LTC4、LTD4、LTE4均为白三烯家族成员，作为趋化因子参与免疫应答。

此外，5-LOX能够促进活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，激活相关信号通路，加重组织氧化应激损伤，加速疾病发展[9～11]。高浓度的高金雀花碱能够激活原代肌细胞的5-LOX，使胞内ROS产生增加，同时NADPH氧化酶表达上调，Zileuton能够增加胞内N-乙酰半胱氨酸的生成而减少高金雀花碱诱导的ROS增加，缓解原代肌细胞损伤[12]。同时，5-LOX参与了多种疾病的组织纤维化[13, 14]。芳香烃受体的配体TCDD通过激活5-LOX增加了人原代肺纤维母细胞系HFL-1和CCL-202细胞的迁移和分化，同时成纤维细胞分化标志物α-SMA表达增加，而选择性5-LOX抑制剂和芳香烃受体特异性拮抗剂CH223191均能够减少HFL-1和CCL-202细胞的迁移和增殖以及α-SMA表达，从而缓解肺纤维化[15]。

Zileuton是通过抑制白三烯生成，抑制炎性及免疫信号通路，或者是通过改善心肌重构过程中过度激活的氧化应激，从而抑制心肌重构和改善心功能，目前并不清楚，需要进一步探索。但从已得到的表型数据显示，5-LOX有可能成为抑制心肌重构、防治心力衰竭的新靶点。