葡萄灰霉病抗性快速鉴定技术与应用

方献平，查倩，奚晓军，和雅妮，蒋爱丽*

（上海市农业科学院林木果树研究所，上海 201403）

葡萄灰霉病是由灰葡萄孢菌引起的一种极具威胁性的真菌性病害。病菌分生孢子梗灰黑色，呈树状分枝，在相对湿度75%～100%时快速生长[1]。灰葡萄孢菌在2～31 ℃下均能对新梢、叶片、果梗、花序和果实产生危害。葡萄染病后，新梢和叶片会出现褐色病斑或灰色霉层，花序萎缩，幼果脱落，成果有凹陷病斑[2]。

近年来，随着葡萄产业的发展，葡萄灰霉病防控越来越引起生产者的重视。一方面可通过田间管理降低其危害，另一方面选用抗性品种降低发病风险。然而灰霉病抗性品种材料筛选周期较长、成本高；植物病害的离体抗性鉴定技术由于不受场地限制，具有省工、省时、方便快速和准确性高等优点，已经在黄瓜[3]、辣椒[4]和苹果[5]等作物上广泛应用。在灰霉病抗性鉴定研究方面，任志华等也做了积极有益的探索，在预先设定好的22 ℃和90%的相对湿度下直接进行病菌接种，取得了比较好的鉴定结果[6]。本研究拟在前人研究的基础上，通过设置不同的接种温度、湿度和时长，探索灰葡萄孢菌侵染葡萄叶片的最佳发生条件，建立葡萄灰霉病抗性快速鉴定方法，并在现有葡萄品种（系）上进行应用，以缩短抗性材料的筛选年限，加快育种进程。

1 材料及方法

1.1 材料

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）由本课题组分离纯化，并经过形态学观察和分子鉴定。对灰葡萄孢菌接种温度、湿度和时长等发病条件开展研究试验的3个葡萄品种为：‘巨峰’‘夏黑’‘金手指’。进行应用试验的另外再加‘醉金香’‘信浓乐’‘阳光玫瑰’‘申爱’‘申丰’‘申华’‘申玉’‘沪培1号’‘沪培3号’9个品种；以及6个品系‘沪20’‘沪21’‘沪22’‘沪24’‘沪27’‘沪28’。

1.2 方法

选用在PDA培养基上培养1周的菌落，使用打孔器进行打孔，将打孔后的菌饼铺在葡萄叶片背面，并放入人工培养箱（上海皓庄，型号LI280A）中培养，设置不同的温度（15 ℃、20 ℃和22 ℃）、相对湿度（80%、90%和95%）和时长（2 d和3 d）组合观察记录叶片感染情况，并用智能叶面积测量系统（托普云农，型号YMJCH）测算病斑面积。

2 结果与分析

2.1 接种后温度对葡萄叶片灰霉病抗性的影响

为了摸索灰葡萄孢菌的最佳侵染温度，预先统一设定90%的固定相对湿度培养条件，并在2 d后观察病症表现。在选定的3个品种中，‘巨峰’呈现出不同温度培养条件下的显著感病差异，在20 ℃时发病最为明显，病斑面积达到了855.30 mm2。‘夏黑’和‘金手指’在20 ℃时发病程度比在22 ℃稍高，20 ℃时病斑面积分别达到了326.85 mm2和186.27 mm2。3个品种在15 ℃下，接种2 d后都未见到感病症状，病斑面积都为0（图1）。由此可见，20 ℃可以作为葡萄叶片抗性鉴定过程中灰葡萄孢菌的最佳接种侵染温度。

2.2 接种后相对湿度对葡萄叶片灰霉病抗性的影响

在已经明确20 ℃为最佳侵染温度的基础上，设置了80%、90%和95%相对湿度培养条件，并在2 d后观察病症。在选定的3个品种中，‘巨峰’和‘夏黑’都呈现出在90%和95%相对湿度培养条件下更易发病的现象，‘金手指’则在相对湿度80%时发病程度稍重于95%时发病程度，病斑面积分别为167.42 mm2和75.43 mm2，推测可能与品种差异有关。但‘巨峰’‘夏黑’和‘金手指’3个葡萄品种叶片都在相对湿度为90%时发病程度达到最大值，而更高的相对湿度并未进一步加快发病进程（图2）。由此可见，灰葡萄孢菌接种葡萄叶片过程中的最佳相对湿度为90%。

图1 在不同温度条件下灰葡萄孢菌侵染3个不同葡萄品种叶片的病斑面积比较Figure 1 Comparison of lesion area of three different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea at different temperatures

图2 在不同湿度条件下灰葡萄孢菌侵染3个不同葡萄品种叶片的病斑面积比较Figure 2 Comparison of lesion area of three different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea at different humidity

2.3 接种时长对葡萄叶片灰霉病抗性的影响

在明确最佳接种温度20 ℃和相对湿度90%的灰葡萄孢菌侵染后，进一步探索了能较明显区分发病差异程度的最佳病菌接种时长。结果发现，尽管侵染时间从2 d延长到3 d，能进一步加剧感染病斑的扩大，但同时不同品种对病菌的抗性区分度在变小，差异系数从0.899降到了0.225（图3）。由此可见，灰葡萄孢菌接种2 d后的病情指标，可以较好地区分不同葡萄品种对灰霉病的抗性差异。

2.4 快速抗性鉴定方法在葡萄品种（系）上的应用

应用建立好的离体叶片快速抗性鉴定方法，在20 ℃和相对湿度90%条件下接菌2 d，18个葡萄品种（系）叶片的抗性研究结果显示：以‘巨峰’为对照，葡萄品系‘沪22’对灰霉病菌的受感染程度最小，感病面积只有3.8 mm2，显示出高抗性；其余品种（系）抗性从高到低依次为‘申丰’‘沪培1号’‘金手指’‘夏黑’‘申玉’‘沪20’‘申华’‘信浓乐’‘沪24’‘沪28’‘阳光玫瑰’‘申爱’‘巨峰’‘沪培3号’和‘醉金香’，而‘沪21’和‘沪27’两个品系显示对灰霉菌高感症状，感染病斑面积分别达到了1158.12 mm2和1256.64 mm2（图4）。

3 讨论与结论

低温、高湿一般是灰霉病流行的主要影响因素，然而并非所有的低温都符合最佳发病生长条件。本研究通过系统比较不同温度、湿度和接种时间长短，进一步发现20 ℃比15 ℃和22 ℃更加适合灰葡萄孢菌的繁殖；90%的最佳相对湿度则进一步佐证了任志华等研究中试验条件设置的科学性[6]，而95%的相对湿度未进一步有效促进病菌的侵染进程。这一发现在生产上提供了重要指导意义，因此葡萄灰霉病的防治可以通过控制温湿度来进一步抑制病害的发生。

图3 在不同接种时长下灰葡萄孢菌侵染3个不同葡萄品种叶片的病斑面积比较Figure 3 Comparison of lesion area of three different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea at different time points

灰葡萄孢菌能侵染葡萄各个生长阶段，而抗病性鉴定是葡萄育种过程中非常关键的一环；通过抗性材料的筛选可以进一步明确育种方向，加快育种进程。葡萄抗病性鉴定可以分为田间鉴定和室内鉴定，其中田间鉴定操作相对繁琐，必须考虑到当时的气候条件，有些自然情况下存在不发病的情况。如果在田间用人工接种的方法，则必须充分制造发病的条件，并且经常需要选择适合发病的生长地块。而室内鉴定从实施步骤上来说则相对简单，操作可控性更强。可以借助人工气候室或者培养箱，调控合适的温度和湿度，创造有利于植株发病的气候条件，没有气候的限制。对于想通过快速鉴定手段来达到抗性材料筛选的目的，室内鉴定可以更好的实现这一目标。室内鉴定法已经应用于葡萄抗白粉病[7-8]、霜霉病[9]和黑痘病[10-11]等相关抗性资源鉴定的工作中。在灰霉病种质资源抗性鉴定方面，Gabler等[12]通过研究不同葡萄品种果实对灰霉菌的抗性特点，确定圆叶葡萄和美洲种具有较好的抗性。段慧[13]也通过研究初步确定了刺葡萄1、4号高抗灰霉病，而刺葡萄2、3号高感灰霉病。本研究首先以有抗性差异的3个葡萄品种叶片材料，对灰葡萄孢菌接种温度、湿度和时间长度等发病条件进行研究，形成了葡萄灰霉病抗性离体叶片快速鉴定方法，并应用该法对‘巨峰’‘夏黑’‘金手指’‘醉金香’‘阳光玫瑰’和申沪系列等在内的18个葡萄品种和杂交株系的灰霉病抗性进行了鉴定和比较。结果表明，温度20 ℃、湿度90%是灰葡萄孢菌的最佳侵染条件，在此条件下接种2 d后的病情指标可以较好地区分18个葡萄品种（系）对灰霉病的抗性差异，其中葡萄新品系‘沪22’对灰葡萄孢菌显示高抗，而‘沪21’和‘沪27’两个品系高感灰霉病。

图4 灰葡萄孢菌对18个不同葡萄品种（系）叶片的侵染病斑面积比较Figure 4 Comparison of lesion area of eighteen different grape varieties leaves infected by Botrytis cinerea