Toll样受体家族基因变异与结核易感相关性的研究进展

吉桂宜，唐怀蓉，黄 燕，张苗苗，吴寿全，王 羽，贺建清※

(四川大学华西医院 a.健康管理中心，b.呼吸与危重症医学科，成都 610041)

结核是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性传染病[1-3]。2017年，全球有新发结核病1 400万，同时有约160万人死于结核[1]。中国是结核高发国家，发病率达63/10万[1]。据报道,全球约1/3的人口感染结核分枝杆菌，然而仅5%～15%的感染者发展为活跃结核，其余人群以潜伏结核感染的状态存在，表明结核易感性存在个体差异[4]。研究表明，宿主基因因素在结核的发病机制中起重要作用[5-6]。目前，已发现了许多重要的与结核易感性相关的候选基因，如细胞因子及其受体基因[肿瘤坏死因子、白细胞介素(interleukin,IL)-1β及IL-6]、趋化因子及其受体基因(趋化因子配体10及受激活调节正常T细胞表达和分泌因子)和模式识别受体基因[Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、甘露糖受体及Dectin-1(树突状细胞相关C型凝集素1)]等[5-6]。

机体依赖固有免疫反应及Th1细胞介导的适应性免疫反应来抵御结核分枝杆菌的入侵。TLRs是一类进化保守的胚系编码的模式识别受体，可通过识别细菌的保守结构从而在机体免疫反应中发挥重要作用[7]。在结核分枝杆菌感染初期，TLRs就参与固有免疫反应,可促进巨噬细胞的直接杀伤功能和树突状细胞的分化成熟，激活获得性免疫反应[8]。多项研究表明，TLRs的基因变异与结核易感性之间存在相关性[9-11]。现就TLRs基因变异与结核的相关性进行综述，为探索新的抗结核治疗方法提供理论依据。

1 TLRs简介

TLRs广泛存在于哺乳动物、人类、昆虫及植物中。Toll蛋白最早是在果蝇体内发现的，称为dToll，1997年，研究者首次在人体内分离出dToll的同系物，命名为TLR4[12-13]。目前，已发现哺乳动物有11种TLRs，其中，人类的10种TLRs是具有功能的[14]。人类TLRs属于Ⅰ型跨膜蛋白受体，由胞外区、跨膜区及胞内区三部分组成[15]。胞外区由24个富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats，LRR)组成，可识别病原体；跨膜区是富含半胱氨酸的结构区域，与LRR区的C端连接；胞内区结构较保守，含200个氨基酸，与IL-1受体和IL-18受体的胞内区具有高度的同源性，因此，又被称为Toll/IL-1受体同源区(Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR)，它是TLRs向下游信号转导的重要部分[15-17]。相较于胞内区，不同TLRs的胞外区差异较大，这有助于对不同病原微生物配体的识别。

TLRs在人体中分布广泛，不同细胞的TLRs种类存在差异。TLR1主要分布于单核细胞、树突状细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞及多形核白细胞；TLR2、TLR4、TLR5广泛表达于除淋巴细胞及自然杀伤细胞外的免疫细胞；TLR3主要分布于未成熟的树突状细胞等[15]。不同的TLRs分布于细胞的不同区域，如TLR1、TLR2、TLR4、TLR6分布于细胞表面，TLR3、TLR7、TLR8、TLR9分布于细胞内[15]。每种组织至少表达一种TLRs，不同组织器官的TLRs种类和数量也存在差异，如脾脏和外周血中可表达全部的TLRs，而与外界接触的部位(如呼吸道)，TLRs的种类和数量均是最多的[18-20]。

TLRs最主要的功能是促进细胞因子的合成与释放，引起炎症反应，同时还可促进免疫细胞的成熟与功能化，从而介导机体的固有免疫及获得性免疫反应[21]。它主要通过以下两条信号途径发挥作用[15,22]：①髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依赖途径。当TLRs被激活后，诱导活化其下游的MyD88及IL-1受体相关激酶[15]。除TLR3外的TLRs均可激活该通路。其中，仅TLR2与TLR4需要MyD88和TIR功能区的接头蛋白协同作用完成信号转导[15,23]。②MyD88非依赖途径。当TLRs被激活后，诱导活化其下游的肿瘤坏死因子受体相关因子6。TLR3及位于内涵体上的TLR4通过该通路发挥作用[23]。两条途径均可进一步活化核因子κB，引起级联信号放大反应，从而启动各种炎症细胞因子基因的转录，产生一系列免疫和炎症反应[22]，见图1。

2 TLRs与抗结核感染

固有免疫反应是机体对抗结核分枝杆菌感染的第一道也是非常重要的屏障。人体吸入结核分枝杆菌后，首先激活肺泡巨噬细胞及树突状细胞产生的固有免疫反应[24]。在感染初期，吞入巨噬细胞内的结核分枝杆菌可进行胞内复制，并可有效穿过肺泡间隔播散到肺外组织[24]。胞内复制及病原体的传播发生在适应性免疫反应之前，表明结核分枝杆菌可建立一种避免被机体免疫系统清除并可持续存在的独特自我保护机制[25-26]。固有免疫系统有各种模式识别受体，它们存在于全身各个器官和组织中[27]。模式识别受体可特异性识别病原相关分子模式，从而启动并调节机体的固有免疫反应[28]。

TLRs:Toll样受体；MyD88：髓样分化因子88；IRAK：白细胞介素1受体相关激酶；TRAF6：肿瘤坏死因子受体相关因子6；NF-κB：核因子κB

图1TLRs作用过程

TLRs属于模式识别受体中的一种，它可通过识别结核分枝杆菌的病原相关分子模式，从而诱导机体产生保护性免疫反应或炎症反应。10种TLRs中，仅6种(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR8和TLR9)与结核分枝杆菌的识别相关[14]。结核分枝杆菌细胞表面存在与TLRs等受体相互作用的重要配体，包括分子量为19 000～27 000的脂蛋白、38 000的糖脂蛋白、阿拉伯糖甘露聚糖脂和磷脂酰肌醇甘露聚糖[15]。不同的TLRs家族成员可识别不同的成分，如TLR2可识别脂蛋白、阿拉伯糖甘露聚糖脂及磷脂酰肌醇甘露聚糖，TLR4可识别脂多糖，而TLR9可唯一识别细菌DNA中的CpG序列[13,15]。不同的TLRs之间还可形成异源二聚体的组合识别形式，从而扩大对病原相关分子模式的识别范围，如TLR1/TLR2和TLR2/TLR6[13,29]。TLRs与病原相关分子模式相互作用而启动细胞内信号转导通路，通过MyD88依赖途径或MyD88非依赖途径最终激活核因子κB，从而使编码各种细胞因子及受体分子等的基因转录，引起多种细胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、肿瘤坏死因子α及γ干扰素等)和趋化因子的表达[15,30]。

3 TLRs基因变异与结核易感性

3.1TLR1基因变异与结核易感相关性 TLR1又称CD281，由胞外区、跨膜区及胞内区组成，各部分氨基酸含量分别为581个、23个和181个，共含786个氨基酸[31]。TLR1可在脾脏及外周血中高表达[31]，在机体对抗结核分枝杆菌感染中起重要作用。Hawn等[32]在西雅图及越南人群中的研究发现，TLR1编码区存在17种变异[主要是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)]，其中，7种属于同义突变，包括C114T(H38H),A914T(H305L)，C944T(P315L),T1583C (C528C),G1677A(P559P),T1760G(V587G),T1892G (L631R)，10种属于非同义突变，包括G1968A(L656L),C2198T(P733L),T130C(S44P),A1482G(V494V),C1938T (H646H),G239C(R80T),C352T(H118Y),A743G(N248S),A1518G(S506S)和T1805G(I602S)，非同义突变中有7种在胞外区，2种在胞内区。

研究表明TLR2可分别与TLR1及TLR6形成受体对，从而扩大对病原菌的识别，其胞外区的LRR区可使TLR1/2及TLR2/6受体对多种微生物受体激动剂表现出不同的特异性[33-35]。Omueti等[36]发现，TLR1的LRR区域有3个非同义突变SNPs(rs4833095、rs3923647和rs5743613)，其中，rs5743613位点可能会影响许多感染性疾病的固有免疫反应及易感性。研究显示，TLR1多态性，如rs4833095A和 rs5743618G，可使其在细胞表面表达缺失和功能缺陷，从而极大地影响结核易感性[37]。rs5743611、rs4833095和rs5743618位点变异均为非同义突变SNPs，研究发现，它们与侵袭性曲霉病及克罗恩病的易感性相关[38-39]。据报道，rs5743618G也可降低结核的易感性并增加疟疾及幽门螺杆菌诱导的胃疾病的发生风险[40-42]。在美国人中，rs4833095、rs5743618、rs3923647和rs5743613位点均可影响抗结核免疫反应及麻风病的易感性[43]。rs4833095位点位于TLR1的跨膜区，可影响受体的转导和功能，与美国人的结核易感性相关[43]。Dittrich等[10]报道，rs4833095A可降低印度人结核的易感性，并且在体外实验中它可增强对结核分枝杆菌溶解产物的免疫反应。Sinha等[44]对印度人群的研究也发现，rs4833095A可降低北印度人的结核易感性。rs5743618(602Ile/Ser)是核因子κB信号通路上重要的功能位点，在美国黑人的研究中发现，该位点可影响结核易感性[43]；Qi等[45]在中国汉族儿童中的研究也发现，该位点与结核易感性相关；而Ma等[46]研究发现，该位点在中国汉族人中的最小等位基因频率极低，小于2%，与汉族人的结核易感性之间并不存在相关性；Sinha等[44]也发现该位点的多态性与北印度人的结核易感性不相关。

3.2TLR2基因变异与结核易感相关性 TLR2由784个氨基酸组成，其胞外区含588个氨基酸，跨膜区含21个氨基酸，胞内区含175个氨基酸[47]。在抗结核分枝杆菌感染中，TLR2对巨噬细胞的活化起重要作用[48]。TLR2可识别分子量为19 000的脂蛋白，促进炎性细胞因子的产生，如主要由Th1细胞分泌的肿瘤坏死因子α和γ干扰素[49-52]。免疫反应的激活不仅需要吞噬作用，还需要功能性TLRs的参与。目前，关于TLR2功能性SNPs的报道较少。研究发现TLR2基因多态性可能会降低巨噬细胞对细菌多肽的反应，从而导致机体免疫反应减弱[53]。Texereau等[54]对TLR2的17个SNPs进行研究发现了9个可引起氨基酸改变的非同义突变SNPs。TLR2的胞外区非常重要，可分别与TLR1或TLR6形成异源二聚体，特异性结合不同的配体，从而扩大对微生物的识别谱[33-35]，研究者在该区域发现了5个SNPs，其中3个(rs5743708、rs12191786和Pro681His)可通过阻止TLR2与MyD88结合而减弱核因子κB的活化，从而影响细胞信号转导及炎性细胞因子的产生[54-58]。Pro681His主要出现在亚洲和非洲人群中，在白种人中暂未发现，据报道，该错义突变与韩国人的结节性麻风及突尼斯人的结核易感性均相关[59-60]。rs5743708和rs12191786是两个重要的功能位点，目前关于TLR2基因多态性与结核易感性的研究大多集中在这两个位点。研究显示，它们分别与土耳其人及突尼斯人的结核易感性相关[60-61]。在中国人群的研究中发现，rs5743708和rs3804099位点与肺结核的发病相关，rs3804100变异在结核潜伏感染者中的频率高于未感染结核分枝杆菌的健康人群[62-63]，Sun等[64]报道，rs5743708位点的多态性与结核易感性相关；而Ma等[46]发现，在中国汉族人中，rs5743708位点的多态性与肺结核易感性之间不相关；rs1898830和rs3804099的多态性与中国汉族儿童的结核易感性也不相关[65]。Wu等[62]在中国人群中进行基因-基因及基因-环境相互作用分析发现，TLR2 rs3804100、TLR2 rs1898830和TLR4 rs10759931交互作用预测肺结核的准确性可达80%。

3.3TLR4基因变异与结核易感相关性 TLR4含839个氨基酸，细菌的脂多糖及脂磷壁酸均可将其活化，脂多糖及脂磷壁酸首先结合在CD14受体簇上，然后转移给TLR4，形成同源二聚体，再与髓样分化蛋白2组成复合体，最后运输到细胞表面[73-74]。TLR4的跨膜区(第632～839位氨基酸)对于其功能性寡聚反应来说至关重要，该区域有一个错义突变Val651Phe，它可改变TLR4对脂多糖的反应[75]。研究者在LRR区发现了5个低频的错义突变(Ser73Arg、Ala97Val、Tyr98Cys、Thr175Ala和rs4986791)，这些突变在高加索人中较常见，但在越南人中也可见Thr399Ile频率的改变[76-77]。一般情况下，氨基酸的改变可能会影响蛋白质的结构和功能，但Tyr98Cys和Thr175Ala错义突变是否改变了TLR4的功能目前尚不清楚。rs4986790和rs4986791是TLR4基因LRR区的两个错义突变位点，它们可影响TLR4胞外结构域，降低对脂多糖的反应，从而减少细胞因子的释放，使结核分枝杆菌逃避机体的免疫监视，导致感染性疾病易感性增加[78-82]。在坦桑尼亚人群中，rs4986790位点的多态性与人类免疫缺陷病毒感染者的结核易感性相关，但在冈比亚及墨西哥人群中未发现此种相关性[83-85]。研究者在韩国、中国台湾及日本人群中均未发现rs4986790和rs4986791位点的SNP[86-87]。Wu等[62]在中国人群中的研究发现，rs7873784 G在肺结核患者中的频率高于健康人，基因-基因及基因-环境相互作用分析显示，该基因的rs10759932、rs7873784和rs10759931三个位点交互作用预测结核潜伏感染的准确性为84%。

3.4TLR6基因变异与结核易感相关性 TLR6由796个氨基酸组成，仅有1个外显子[88]，它表达于脾脏及外周血白细胞上，可与TLR2形成异源二聚体，识别多种配体，如可溶性结核因子[89]，TLR6被激活后，产生细胞信号转导，核因子κB活化，引起细胞因子分泌及炎症反应。研究者对中国广东人的研究发现，在TLR6基因编码区有7个SNPs，其中5个SNPs是错义突变[Met59Thr(+176T/C),Ile120Thr(+359T/C),Val327Met(+979G/A),Val465Ile(+1393G/A)和Val470Leu(+1408G/T)]，另外2个SNPs(+1083C/G和+1263A/G)没有氨基酸替换[14]。研究发现非同义突变位点rs5743810的多态性可影响结核易感性[90]；Ma等[43]在美国黑人的研究中发现，该位点多态性与结核易感性相关；Sun等[64]研究也发现该位点与结核的发病相关；而Sinha等[44]在北印度人的研究中并未发现此相关性，在中国人群的研究中也未发现该位点的多态性与结核易感性之间存在相关性。

3.5TLR8基因变异与结核易感相关性 TLR8位于X染色体上，可识别病原微生物的单链RNA，如RNA病毒[14]。Davila等[11]首次研究了该基因的149个SNPs与印度尼西亚及俄罗斯人群的肺结核易感性之间的相关性，结果发现，在印度尼西亚和俄罗斯男性中，有4个SNPs与肺结核明显相关，其中，3个SNPs(-129 C/G、-2167 A/G和-1145 A/G)在调节区，1个SNP[rs3764880，1A/G(Met/Val)]在起始密码子区。携带Met/Val的印度尼西亚男性Met等位基因可增加结核的易感性，而Val等位基因可降低结核的易感性[11]。在土耳其儿童中也发现了此种相关性，但未发现-129 C/G SNP与结核易感性相关[91]。Salie等[92]在南非人群中的研究发现，rs3761624、rs3764879和rs3764880三个位点与女性结核易感性相关，而rs3764879和rs3764880两个位点与男性结核易感性相关。由此可见，TLR8基因的多态性影响疾病易感性可能与性别相关。另外，在中国人群中的研究发现，rs3764879 CC基因型频率在肺结核患者中的分布明显高于健康人群，而李彤等[93]在中国东北地区汉族人中的研究并未发现TLR8 SNPs与结核易感性相关。目前，TLR8识别结核分枝杆菌及其胞内信号转导的机制尚不清楚。

3.6TLR9基因变异与结核易感性相关性 TLR9由1 032个氨基酸组成，含2个外显子[94]，它是哺乳动物细胞识别细菌DNA中的非甲基化CpG序列的主要受体[95]。研究表明TLR9可使树突状细胞释放IL-12，从而抵抗结核分枝杆菌的感染，TLR9缺失的小鼠易感染结核分枝杆菌，而TLR2与TLR9同时缺失的小鼠更易感染结核分枝杆菌[96-97]。rs5743836位于启动子区域，可能影响TLR9基因的转录调节；rs352139位于内含子区域，与印度尼西亚女性的结核易感性相关[98-99]；rs187084C可增加印度Baiga部落人群患肺结核的风险[100]；但在印度南部人群的研究中发现，启动子区基因多态性(rs5743836和rs187084)与结核易感性间不存在相关性[101]。另外，Collins等[102]进行基因-基因交互作用分析发现，PTX3 rs2305619、TLR9 rs187084和DC-Sign rs11465421三个位点交互作用，预测结核病的准确度为58.8%。

TLR9的活化对结核分枝杆菌引起的肺肉芽肿性反应的维持至关重要，但其机制尚不清楚[14]。启动子区的SNPs可通过改变基因转录因子的结合潜在地影响基因表达水平，而内含子区域的SNPs可影响mRNA的拼接和(或)增强基因的转录[14]。Carvalho等[103]发现，携带-1237 TC基因型的外周血单核细胞TLR9和IL-6均高表达，在CpG DNA的刺激下，B细胞的增殖也增加，但机制尚不清楚。

3.7TLR10基因变异与结核易感相关性 TLR10高表达于淋巴组织系统，如淋巴结、扁桃体等，在机体抵抗病原微生物的免疫反应中起重要作用。有研究报道，TLR10与TLR1及TLR6在染色体4p14上有共同的基因座，因此，三者在结构上具有相似性；TLR10可与TLR1或TLR6形成异源二聚体，而TLR1和TLR6均可与TLR2形成受体对，从而扩大对病原微生物的识别，在机体抗炎过程中起重要作用[104]；Oosting等[105]发现，TLR10可通过巨噬细胞表面的TLR2起抗炎作用。TLR10 rs4129009A和TLR10 rs10004195T均可增加韩国儿童自身免疫性甲状腺疾病的发生风险；而TLR10 rs10004195AA基因型则可降低该病的发生风险，TLR10 rs11096956位点的多态性与自身免疫性甲状腺疾病的发病无相关性[106]。目前，关于TLR10基因多态性与结核易感性之间相关性的研究较少。Bulat-Kardum等[107]报道，TLR10 rs11096957A等位基因可增加克罗地亚人结核的发病风险。

4 结 语

模式识别是宿主抗结核分枝杆菌感染的重要组成部分，它通过TLRs促发抑制机制。TLRs信号间可通过各自的配体进行协调调节，这种协调调节可控制宿主抗结核分枝杆菌感染的免疫反应的程度，在抗结核分枝杆菌的感染中至关重要[14]。TLRs基因的变异(尤其是SNPs)极大地影响了结核的易感性，有独特TLRs表型的个体可能对结核分枝杆菌配体有或高或低的亲和力[14]。因此，需要进一步的深入研究来系统地探索TLRs、接头蛋白(MyD88、TIR功能区的接头蛋白、TRIF、 TRAM)和下游分子(如IL-1受体相关激酶和肿瘤坏死因子受体相关因子6)三者之间的相关性，这有助于全面而深入地理解它们的分子生物学特性，评估各种SNPs联合突变的累积效应。