不同检测方法在结核性脑膜炎诊断中的应用价值

高漫 白广红 周祎 王卓

作者单位：710100 西安，陕西省结核病防治院

结核性脑膜炎在结核病患者中约占1%，但是病死率极高[1-2]。早期诊断及尽早治疗是降低结核性脑膜炎病死率和致残率的关键所在。目前，公认分子生物学方法具有敏感、快速、特异、高效等优点，尤其适用于结核性脑膜炎的快速诊断。本研究探讨了结核分枝杆菌BACTEC MGIT 960液体快速培养(简称“MGIT 960培养”)、RNA恒温扩增实时荧光检测技术(SAT-TB技术)、聚合酶链式反应-荧光探针检测技术(简称“PCR技术”)、GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”技术)4种检测方法对结核性脑膜炎的诊断价值，以期为提高结核性脑膜炎的早期诊断提供参考依据。

资料和方法

一、研究对象

1. 研究对象的选择：搜集陕西省结核病防治院2015年5月至2017年5月期间519例疑似结核性脑膜炎住院患者作为研究对象，其中男336例，女183例，年龄9～79岁，平均年龄(43.97±17.58)岁。以H37Rv标准株为阳性对照，519例患者标本同时采用结核分枝杆菌MGIT 960培养和SAT-TB、PCR技术、GeneXpert技术进行检测。

2. 诊断标准：参照文献[3]的诊断方法，354例患者被诊断为结核性脑膜炎，其余165例排除结核性胸膜炎的诊断。165例患者最终根据临床用药治愈的结果诊断为化脓性脑膜炎102例、病毒性脑膜炎59例、新型隐球菌性脑膜炎4例。

3. 知情同意：本研究通过本院伦理委员会审核，获得所有患者知情同意。

二、试剂与仪器

MGIT 960系统及培养管、试剂盒由美国BD公司生产；SAT-TB检测试剂盒由上海仁度生物科技有限公司生产，扩增仪为上海宏石医疗科技有限公司生产的9GP型PCR扩增仪。晶芯®分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR检测试剂盒)由博奥生物集团有限公司生产，扩增仪为上海宏石医疗科技有限公司生产的9GP型PCR扩增仪。GeneXpert仪器及试剂盒由美国Cepheid公司研发生产。

三、方法

1. MGIT 960培养：取3 ml脑脊液标本于无菌离心试管中以3000×g离心15 min富集，培养管中加入0.8 ml营养添加剂与杂菌抑制剂混合物；取0.5 ml样本沉淀接种至MGIT培养管上机培养。若培养阳性，约15 d报告阳性结果，培养42 d后若未报告阳性则判断为阴性[4]。

2. SAT-TB技术：取1 ml脑脊液置于1.5 ml离心管中，3500×g离心5 min，弃上清；加无菌生理盐水振荡混匀，3500×g离心5 min，弃上清；加入50 μl稀释液，混匀；将阴性和阳性对照样品和准备好的样本放入功率200 W的超声破碎仪中进行超声破碎15 min。微量反应管中每管加扩增检测液30 μl，再加入破碎好的样本2 μl，放入干热恒温仪，加热至60 ℃持续10 min，42 ℃持续5 min，之后保持在42 ℃的温度下加入MMLV反转录酶和T7聚合酶的混合酶液；最后通过9GP型PCR扩增仪进行扩增，然后判读结果。

3. PCR检测：取1 ml脑脊液至1.5 ml离心管中，3500×g离心5 min，弃上清；加入1 ml洗液离心，弃上清，吸干剩余的液体，注意不要碰到或吸走沉淀；提取核酸；将核酸提取管置于95 ℃金属浴5 min后，取出核酸提取管，3500×g离心1 min后备用；加2 μl模板DNA或对照品至扩增反应液管中；PCR扩增，判读结果。

4. GeneXpert技术：取3 ml脑脊液以3000×g离心15 min 后富集，留取1 ml沉淀；加入1 ml样本处理液混匀15 min，然后将2 ml样品混合物加入到GeneXpert检测匣中，按照生产商使用说明，将检测匣装载到GeneXpert仪器中，上机，自动判读结果。

5. 研究内容：对MGIT 960培养和SAT-TB、PCR、GeneXpert 技术检测的诊断效能进行比较，探讨各检测技术诊断结核性脑膜炎的价值。

四、统计学处理

采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。比较4种检验方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值及其95%CI值。

结 果

519例研究对象中，临床脑脊液标本应用MGIT 960培养、SAT-TB技术、PCR技术、GeneXpert技术同时进行检测，结果见表1。以临床诊断为标准，GeneXpert技术检测结核病的敏感度高于MGIT 960培养、SAT-TB技术和PCR技术。MGIT 960培养检测结核病的敏感度高于SAT-TB和PCR技术。

表1 以临床诊断为标准4种技术检测结核性脑膜炎的效能比较

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；“-”表示不存在相关数据

讨 论

目前，结核性脑膜炎的诊断需依据典型的临床表现、神经影像学特点、脑脊液改变和对抗结核药物治疗有效进行综合判定，明确诊断的主要依据为脑脊液细胞涂片或细菌学培养发现结核分枝杆菌[5]；而在细菌学诊断中，涂片抗酸染色和培养法一直是大家熟知的方法，但是由于涂片阳性检出率极低，培养周期长，免疫学方法中结核分枝杆菌潜伏感染、既往感染及宿主全身免疫状态等干扰因素，假阳性率和假阴性率都较高[6]，影响结核性脑膜炎患者的早期诊断和治疗。所以快速、简便、敏感度和特异度高的诊断方法对结核性脑膜炎的诊断尤为重要。

MGIT 960培养及菌种鉴定为结核病诊断的标准[7]，还能进行药物敏感性试验；在本研究中该技术检测的敏感度为23.7%，高于SAT-TB和PCR技术，仍是不可缺少的方法；但其操作繁琐，培养周期长，对实验室要求较高，操作过程中对操作人员及环境有较大威胁。SAT-TB技术的操作简单，2 h内可获得检测结果[8]，对于生命力旺盛的病原体RNA转录活跃，是一个较好的预后指标[9]；在本研究中的敏感度为7.6%，较文献报道的直接涂片法检测的敏感度(2.53%[10])高，还可以区分结核分枝杆菌有无生命力且实验过程中交叉污染较少，可为结核病患者的治疗效果提供参考；但是该技术检测敏感度仍旧较低[11]，由于细菌体内RNA的存在与病原体生命力有关，当病原体无生物活性时，RNA裂解，检测不出结果，敏感度低于DNA检测。PCR技术操作简单，3 h内可获得检测结果，根据标本中结核分枝杆菌的数量及变化趋势可用于判断疗效，MTB-DNA拷贝数下降说明对该药物治疗有效[12]；但是其阳性标本不能区分结核分枝杆菌是否存在生命力。GeneXpert技术将MGIT 960培养至少需要3周才能完成的结核分枝杆菌检测及其对利福平是否耐药的检测时间缩短为2 h[13]，敏感度较本研究中其他3种方法更高，且差异有统计学意义；且GeneXpert技术操作简单，工作人员比较容易学会，整个实验手动操作时间不超过5 min，并且检测结果不会因人而异，整个检测在一个密闭环境中进行，对实验室环境和工作人员有较好的保护[14]。WHO亦推荐GeneXpert技术替代涂片、培养等技术，用于肺外结核的快速诊断。对于基层工作人员来说，该仪器对操作人员、环境要求低，较容易开展，对结核性脑膜炎的诊断具有较高的价值。GeneXpert技术通过观察不同时间点检测时探针循环阈值(cycle threshold，Ct值)的大小结果，可作为半定量评价指标指导临床用药、预后判断等。