不同来源多种虫草核苷类物质检测分析比较

张鑫喆，徐方旭，柳叶飞，王升厚*

（1.沈阳师范大学 生命科学学院，辽宁沈阳 110034；2.沈阳师范大学 实验教学中心，辽宁沈阳 110034）

冬虫夏草、蛹虫草和蝉花虫草为我国虫草领域研究和应用最广泛的三个品系，三者在生物活性成分及生物学功能等方面具有很多相似之处[1]。其中核苷类物质作为虫草的主要活性成分之一，具有广泛的生理功能，至今已从虫草及发酵菌丝中分离鉴定到11种核苷类化合物，包括虫草素、腺苷、腺嘌呤、尿嘧啶、尿苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷和胸腺嘧啶等[2]。多年来，围绕虫草素、腺苷、虫草酸等活性物质的检测与研究已有很多报道，但随着喷司他丁[3]等最新研究成果的出现，表明人们对虫草中存在的潜在重要天然化合物的挖掘和认识尚处于起步阶段。

功能性蛹虫草概念是沈阳师范大学蛹虫草研究团队于2008年提出的，它是以成分指标作为蛹虫草质量标准的评价体系，2016年《一种功能性蛹虫草的培育方法》发明专利获得授权。由于功能性蛹虫草人工培育中需要采用特殊的菌种，独特的培养基配方，以及仿野生的栽培条件，因此所培育的蛹虫草子实体内虫草素含量可以达到很高的水平[4]。本研究旨在通过相同的检测平台对目前三大商业性虫草的核苷类物质进行同步检测与分析，以期获得基础的成分数据，为后续比较研究和应用开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料由沈阳师范大学特种菌业研究所提供，样品名称及代号见表1。

表1 样品名称及代号

1.2 试剂与仪器

试剂：虫草素及腺苷等标准品均购自美国Sigma公司（产品纯度均大于99%），甲醇为色谱纯，试验用水为自制双蒸水。

仪器：安捷伦LC1200液相色谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司

1.3 测定方法

1.3.1 标准品的配制

准确称取胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷、腺苷、虫草素标准品0.005 0 g，分别用去离子水定容至50 mL，配成浓度为0.1 mg/mL的母液。分别量取1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、7 mL标准母液定容至50 mL，配制成浓度为0.002 mg/mL、0.004 mg/mL、0.008 mg/mL、0.012 mg/mL、0.014 mg/mL的胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷、腺苷、虫草素的标准溶液。

1.3.2 核苷类物质提取

将11种样品烘干至恒重，用研磨机粉碎，过80目筛。准确称取待测样品粉末0.500 g，置于广口瓶中，加入蒸馏水80 mL，于85℃水浴环境下提取3.5 h。冷却至室温，离心，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，滤液作为检测样品溶液[5]。

1.3.3 高效液相色谱仪测定核苷类物质含量

测量条件：进样量20 μL、流速0.8 mL/min、波长260 nm、甲醇（有机相）∶超纯水（流动相）=85∶15。

1.3.4 计算核苷类物质含量

2 结果与分析

2.1 样品中胞苷含量分析

样品中胞苷含量的实验结果见图1。由图1可知，11组试验样品中，不同样品的胞苷含量各不相同，其中以功能性蛹虫草蛹体含量最高，含量为9 445.87 mg/kg，功能性蛹虫草子实体中胞苷含量最低为144.48 mg/kg。其中功能性蛹虫草和活蛹虫草的虫体体中胞苷含量均显著高于其子实体（P＜0.05）。功能性蛹虫草子实体、小麦清水草子实体、富硒大米草子实体、活蛹虫草子实体中胞苷含量均存在显著差异（P＜0.05）。功能性蛹虫草蛹体、活蛹虫草蛹体之间也存在显著差异（P＜0.05），野生蝉花虫草和蝉花虫草粉之间胞苷含量差异显著（P＜0.05），而野生蛹虫草和活蛹虫草的子实体和虫体之间也存在极其显著的差异（P＜0.01）。

图1 样品中胞苷含量

2.2 样品中尿苷含量分析

样品中尿苷含量分析的实验结果见图2。由图2可知，11组试验样品中，不同样品的尿苷含量差异显著，其中以野生蛹虫草含量最高，含量为2049 mg/kg，蝉花虫草粉含量最低为365.03 mg/kg。功能性蛹虫草子实体中尿苷含量显著高于功能性蛹虫草虫体，而活蛹虫草虫体中的尿苷却高于活蛹虫草子实体（P＜0.05）。功能性蛹虫草子实体、小麦清水草子实体、富硒大米草子实体、活蛹虫草子实体中尿苷含量均存在显著差异（P＜0.05）。功能性蛹虫草虫体、活蛹虫草虫体之间也存在显著差异（P＜0.05），野生蝉花虫草和蝉花虫草粉之间尿苷含量差异显著。（P＜0.05）而野生蛹虫草和活蛹虫草的子实体和虫体之间也存在显著的差异（P＜0.05）。

2.3 样品中肌苷含量分析

样品中肌苷含量分析的实验结果见图3。由图3可知，11组试验样品中，冬虫夏草的肌苷含量最高，为797.57 mg/kg，功能性蛹虫草虫体、活蛹虫草子实体、和富硒大米草中并不含有肌苷。功能性蛹虫草子实体、小麦清水草子实体尿苷含量均存在显著差异（P＜0.05）。野生蝉花虫草和蝉花虫草粉之间肌苷含量差异显著（P＜0.05）。而野生蛹虫草和活蛹虫草的虫体之间也存在显著的差异（P＜0.05）。

图2 样品中尿苷含量

图3 样品中肌苷含量

2.4 样品中鸟苷含量分析

样品中鸟苷含量分析的实验结果见图4。由图4可知，11组试验样品中的鸟苷含量不同，其中以功能性蛹虫草虫体最高，含量为1 828.88 mg/kg，小麦清水子实体中未检测到鸟苷。功能性蛹虫草虫体中尿苷含量显著高于功能性蛹虫草子实体，而活蛹虫草子实体中的尿苷却显著高于活蛹虫草虫体（P＜0.05）。功能性蛹虫草子实体、富硒大米草子实体、活蛹虫草子实体中尿苷含量均存在显著差异（P＜0.05）。功能性蛹虫草蛹体、活蛹虫草虫体之间也存在显著差异（P＜0.05），野生蝉花虫草和蝉花虫草粉之间鸟苷含量差异显著（P＜0.05）。而野生蛹虫草和活蛹虫草的子实体和虫体之间也存在显著的差异（P＜0.05）。冬虫夏草和活蛹虫草子实体中的鸟苷含量不存在显著差异（P＞0.05）。

2.5 样品中胸苷含量分析

样品中胸苷含量分析的实验结果见图5。由图5可知，对于检测的11种样品，只有功能性蛹虫草虫体、冬虫夏草和野生蝉花虫草中含有胸苷，且三者差异极其显著（P＜0.01）。

2.6 样品中腺苷含量分析

样品中腺苷含量分析的实验结果见图6。由图6可知，11组试验样品中，腺苷含量各不相同，其中以功能性蛹虫草虫体中含量最高，其含量为2 178.05 mg/kg。其次是功能性蛹虫草米基，其含量为1 546.18 mg/kg。活蛹虫草蛹体中并未检测到腺苷。功能性蛹虫草虫体中腺苷含量显著高于其子实体（P＜0.05）。功能性蛹虫草子实体、小麦清水草子实体、富硒大米草子实体、活蛹虫草子实体中腺苷含量均存在显著差异（P＜0.05）。功能性蛹虫草子实体和野生蛹虫草之间不存在显著差异（P＞0.05），野生蝉花虫草和蝉花虫草粉之间腺苷含量差异显著（P＜0.05）。

图4 样品中鸟苷含量

图5 样品中胸苷含量

图6 样品中腺苷含量

2.7 样品中虫草素含量分析

样品中虫草素含量的实验结果见图7。由图7可知，11组试验样品中以功能性蛹虫草米基中虫草素含量最高，其含量为17 367.91 mg/kg其次是功能性蛹虫草虫体，其含量为15 904.70 mg/kg，功能性蛹虫草子实体中虫草素含量高达10 458.25 mg/kg，蝉花虫草粉中并未检测出虫草素。小麦清水子实体与活蛹虫草子实体，活蛹虫草虫体与冬虫夏草之间野生蛹虫草与野生蝉花虫草之间虫草素含量不存在显著差异（P＞0.05）。

3 结论

核苷类成分作为虫草真菌的主要生物活性物质，具有多种功效，临床上已将其应用在多种疾病的治疗上[6]。在对冬虫夏草、蝉花虫草，功能性蛹虫草等11个样品的检测结果显示：11个样品中均含有鸟苷和肌苷，其中只有冬虫夏草、野生蝉花虫草、功能性蛹虫草虫体当中含有胸苷。虫草素、腺苷、胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷含量最多的样品分别为功能性蛹虫草米基、功能性蛹虫草虫体、功能性蛹虫草虫体、野生蛹虫草，野生蝉花虫草、功能性蛹虫草虫体、功能性蛹虫草虫体，其中7种核苷总含量最高的是功能性蛹虫草虫体。笔者认为，虫体中含有丰富的营养成分，会有助于核苷类物质的形成，因为功能性蛹虫草中既添加了小麦培养基与柞蚕蛹，又添加了其他的营养成分，进一步刺激了核苷类物质的形成。功能性蛹虫草的米基中核苷类物质种类也很丰富，认为是由于功能性蛹虫草在生长的过程中代谢出的核苷类物质积累在米基中造成的。本研究对不同的虫草以及蛹虫草的不同部位进行了核苷类检测，得到了一些初步结果，为虫草的进一步开发利用提供了理论依据。

图7 样品中虫草素含量