CRISPR/Cas9技术在基因功能研究中的应用

周芮，张辟

（华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉 430074）

近些年，CRISPR/Cas技术的出现为整个生物领域带来了革命性的变化。研究者利用CRISPR/Cas9基因编辑技术可以快速、准确的实现生物体基因组编辑和动物模型构建。同时，研究人员在CRISPR/Cas9基础上进行多种改造，将其扩展应用于基因表达调控，表观遗传修饰，高通量遗传筛选，基因治疗等方面。基因功能研究是当前生命科学领域的重大课题之一，将CRISPR/Cas9系统应用于基因功能研究领域，取得了众多成果，极大地推动了该研究领域发展，对于揭示基因的生物学功能以及疾病治疗具有重大意义。

1 CRISPR/Cas系统分类及作用机制

CRISPR/Cas系统是细菌为抵御外源DNA入侵进化形成的获得性免疫系统。CRISPR/Cas基因簇由Cas蛋白的编码基因和CRISPR基因序列组成。根据Cas基因组成，效应蛋白复合物不同以及CRISPR自身结构的不同等多个标准，CRISPR/Cas9系统主要分为两大类，一类是形成多效应蛋白复合物的CRISPR/Cas系统，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型；另一类是形成单一效应蛋白的CRISPR/Cas系统，包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型，其中Ⅵ型为新发现的靶向特异性RNA序列的CRISPR/Cas系统[1]。

做为细菌和古细菌的免疫系统，CRISPR/Cas系统的免疫过程大致分为3个阶段。（1）适应阶段。首次入侵的外源DNA的原间隔序列（Protospacer）被宿主菌中的Cas蛋白获取，并作为间隔序列（Spacer）插入到两段重复序列之间。（2）表达阶段。当外源DNA再次入侵时，CRISPR基因座转录生成一段初级转录产物前体RNA（pre-crRNA），再由核糖核酸酶或Cas蛋白加工形成成熟的crRNA。（3）干扰阶段。Cas蛋白与成熟的crRNA形成的复合体特异性识别切割外源DNA序列，造成DNA双链断裂[2]。

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术

CRISPR/Cas9系统属于Ⅱ型CRISPR/Cas系统，该系统不仅需要Cas9蛋白与crRNA（CRISPR RNA），还需要反式激活crRNA（Trans-activting crRNA，tracrRNA）参与CRISPR所调控的免疫过程。在CRISPR/Cas9系统中，tracrRNA会与CRISPR序列转录产物pre-crRNA形成复合物，该复合物与Cas9蛋白结合，经内源RNase Ⅲ和其他RNase酶加工生成成熟的tracrRNA-crRNA-Cas9蛋白复合体。随后Cas9蛋白识别目的DNA的PAM位点（Protospacer adjacent motif)，crRNA与DNA进行碱基互补配对，识别配对成功后Cas9蛋白的两个核酸酶结构域HNH和RucV分别切割DNA两条单链，造成DNA双链断裂。之后研究者根据crRNA-tracrRNA复合体结构将其改造为sgRNA（single-guide RNA），同样可以结合Cas9特异性识别切割靶位点[3]。因此，研究者只需根据目的基因序列设计相对应的sgRNA即可利用CRISPR/Cas9系统在含有PAM元件的靶位点造成DNA双链断裂，进而诱导DNA通过非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）方式进行修复，随机引入多个碱基的缺失或插入，或者通过同源重组（Homology-directed repair，HDR）方式进行自我修复，实现准确的基因敲入，达到基因编辑的目的（图1）。研究者同时转入多个sgRNAs即可实现对多个靶基因进行编辑，基于此特点，研究人员建立sgRNAs文库导入细胞即可实现对基因组进行大规模定点编辑，进而CRISPR/Cas9系统被开发为高通量遗传筛选工具。dCas9是将Cas9两个具有切割活性的结构域RuvC、HNH同时突变失活，使其不具备核酸酶活性。dCas9虽然无法切割DNA双链，但仍可以协同sgRNA特异性识别结合DNA靶序列，基于此特点，研究人员将dCas9蛋白与转录抑制子或转录激活子融合，就可以调控靶基因表达。与此同时，研究人员将dCas9与真核生物DNA甲基转移酶，DNA去甲基化酶或组蛋白修饰酶融合，即可进行表观基因组编辑[4]。

图1 CRISPR/Cas9基因编辑技术原理

3 CRISPR-Cas9系统在基因功能研究领域的应用

3.1 利用CRISPR基因编辑技术进行基因功能研究

CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现使得生物体基因编辑变得更加简单和高效。目前，研究人员已经利用CRISPR/Cas9系统在多种细胞系和生物体中实现基因编辑，通过建立特定基因敲除或敲入的细胞系和动物模型，可以快速准确揭示生理及病理相关基因的具体功能，为疾病治疗提供理论基础。

CRISPR/Cas9技术可以帮助科研人员研究生物体生理活动相关基因的具体功能，揭示人体生理机制。Jang等[5]为研究AMPK基因在自噬小体成熟及其与溶酶体融合过程中所扮演的角色，利用CRISPR/Cas9构建AMPKα1基因敲除的HEK293T细胞系，最终实验结果表明AMPK对于自噬小体的成熟及其与溶酶体融合非常重要。Lloyd等[6]利用CRISPR/Cas9技术构建CG7466基因无效突变果蝇，研究基因功能丧失后的相关表型，发现CG7466基因对于果蝇早期发育是必需的。猪在解剖学和生理学方面与人类极为相似，是生物医学研究领域理想的动物模型。Sheets等[7]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术得到了NGN3基因敲除的小猪，证实NGN3基因对于猪内分泌腺发育是必需的，此类研究为在猪体内培育人体器官提供了宝贵的资源。2018年中科院等科研团队利用CRISPR技术建立了世界首例特定长寿基因敲除的食蟹猴模型，SIRT6基因在啮齿动物中被认为是长寿基因，但在灵长类动物中的生物学功能还未知。研究人员利用CRISPR/Cas9系统，采用一步法构建SIRT6基因在灵长类动物食蟹猴中全身敲除的模型，发现SIRT6基因敲除导致食蟹猴在子宫内出现严重的全身发育迟缓，并在出生数小时内死亡，该研究结果表明SIRT6基因参与调控非人类灵长类动物发育，且该成果为人类围产期致死综合症研究提供可能机制，也为开展人类发育和衰老相关疾病研究奠定了基础[8]。

CRISPR基因编辑技术也可用于研究疾病相关基因，帮助研究人员了解疾病分子机制为疾病治疗提供新的途径。Schleicher等[9]为探究PARP10基因在细胞癌变以及癌细胞增殖中的作用，利用CRISPR/Cas9技术建立了PARP10基因敲除的Hela细胞系，发现PARP10基因敲除抑制了癌细胞的增殖，且在该细胞系重新表达PARP10可以消除其对癌细胞增殖的影响，研究最终表明PARP10可能通过缓解复制压力而促进细胞增殖以及细胞癌变，由此PARP10有望成为癌症治疗中新的靶点。遗传性视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa，RP)是一种神经退行性疾病，在5%～10%RP病例中检测到EYS基因突变，但EYS基因功能以及EYS突变导致RP疾病发生的分子机制仍旧不清楚。Messchaert等[10]以斑马鱼为模型，利用CRISPR/Cas9构建EYS基因敲除型斑马鱼，结果显示，在斑马鱼中EYS基因缺失会导致视网膜结构混乱，引起视觉功能障碍，该EYS基因缺失斑马鱼模型以后也可用于研究EYS突变导致RP疾病发生的机制。2018年，Feng[11]将CRISPR/Cas9技术与体细胞克隆技术相结合，构建了ApoE基因敲除体细胞克隆狗模型，为动脉粥样硬化疾病的研究提供更有效的大动物模型，同时这也是世界首例基因敲除体细胞克隆犬的诞生。同年，Zhu等[12]结合CRISPR/Cas9技术和体细胞核移植技术，成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈病基因敲入迷你猪，该研究为研发治疗亨廷顿舞蹈症新药提供了稳定可靠的动物模型。

3.2 利用CRISPR高通量筛选技术进行基因功能研究

基于CRISPR/Cas9系统开发的高通量筛选技术更加简单和准确，该方法可以让研究者快速找到与某一特定表型相关的基因，揭示人类基因组功能，服务于人类疾病研究及治疗。

CRISPR高通量筛选技术可用于鉴定病毒感染相关宿主基因，为病毒感染疾病治疗提供新的靶标。2018年，Zhang等[13]利用张锋实验室建立的靶向小鼠全部基因组的GeCKOv2文库，以3T3细胞株为模型，筛选出Mrax8受体蛋白是基孔肯雅病毒入侵宿主细胞所必需的宿主受体蛋白，且其他致关节炎甲病毒也需要Mrax8受体蛋白侵入宿主，缺少Mrax8可以减少病毒感染程度，该项研究为多种致关节炎类甲病毒感染治疗提供了有效的靶标。除了进行功能丧失型筛选，研究者也可利用CRISPR/Cas9系统进行功能获得型筛选，用于鉴定宿主细胞内具有抗病毒作用的基因，Heaton等[14]建立了针对基因启动子的sgRNA文库，利用CRISPR协同激活因子系统（CRISPR synergistic activation mediator，CRISPRSAM）对A549细胞株进行基因过表达筛选，发现B4GALNT2基因过表达可以阻断全部禽流感病毒亚型感染，这项研究为抗流感感染药物研发提供了新的靶点，也为以后筛选新的宿主因子提供参考。

基于CRISPR/Cas9系统的高通量筛选技术可以研究参与癌症各个过程的功能基因，为癌症治疗提供更多有效途径。Pan等[15]利用CRISPR/Cas9高通量筛选技术，使用Brie文库，对表达Cas9的小鼠黑色素瘤BI6F10细胞进行筛选，结果显示Pbrm1基因、Arid2基因以及Brd7基因有助于BI6F10细胞抵抗T细胞的杀伤力，而PBRM1基因失活可以使BI6F10细胞对T细胞产生的干扰素更敏感，增强T细胞介导的肿瘤攻击反应，该项研究成果为肿瘤免疫疗法提供新靶点，有望使更多患者受益于免疫疗法。B细胞受体现已成为B细胞淋巴瘤的治疗靶点，依鲁替尼药物是一种BTK抑制剂，在用于患者治疗中仅有部分人产生应答，然而依鲁替尼对具有CD79B基因突变和MYD88基因突变患者高度有效，为探究其中的原因，Phelan等[16]利用Brunello文库对激活B细胞样弥散大B细胞瘤细胞系进行遗传性筛选，发现MYD88蛋白、TLR9蛋白和BCR蛋白形成了多蛋白复合体My-TBCR，该复合体可与mTOR共定位，激活NF-kB和mTOR通路，促进癌细胞存活，该研究为针对弥散性大B细胞瘤特定亚型设计药物提供理论基础。

近些年多项研究显示，非编码RNA在生物体各项生命活动中扮演重要角色，CRISPR/Cas9高通量筛选可以准确，有效用于非编码RNA鉴定和功能分析中。2017年，Joung等[17]建立了靶向10 504个基因间IncRNA转录起始位点的sgRNA文库，协同CRISPR SAM系统可用于研究IncRNA功能，之后他们以黑色素瘤细胞A375为模型筛选维洛非尼药物抗性相关IncRNA，发现有11种IncRNA与细胞抗药性相关，这为研究IncRNA功能以及鉴定新的IncRNA提供有效工具。2018年，Kurata等[18]建立了针对miRNA的sgRNA文库，命名为LX-miR文库，该文库包含8 382个sgRNAs，可有效靶向85%已发现的miRNA，该文库的建立使得miRNA鉴定更加便捷和准确，研究者利用该文库筛选鉴定出影响Hela细胞和NCL-N87细胞生长的miRNA，该文库为探究miRNA在耐药性，病毒感染等其他方面功能提供有效平台。

4 展望

近些年，CRISPR/Cas9技术受到众多科研者的青睐，为基础科学研究以及疾病治疗带来了更多的可能性。然而CRISPR/Cas9系统自身也存在一定局限性，例如脱靶效应、递送工具问题等。针对这些问题，科研人员就多方面不断地探寻解决方法，例如使用纳米材料递送CRISPR/Cas9系统、改变sgRNA二级结构、改变sgRNA的长度等，这些方法均对CRISPR/Cas9技术有明显的改善作用[19-21]。与此同时，科研人员也致力于寻找新的基因编辑系统。CRISPR/Cpf1是2015年张峰实验组报道的新型CRISPR系统，该系统相比于CRISPR/Cas9系统更加简单，近几年也被陆续应用于不同细胞及不生物体的基因组编辑，并且在某些生物体内检测到更低的脱靶效应,且该系统的出现扩展了CRISPR系统作用的靶基因位点范围[22-23]。目前，已有多种新型CRISPR/Cas系统被报道且科研人员不断对系统进行优化改进，相信未来多种CRISPR/Cas系统将一起更好的服务于科学研究和生命健康领域。