BMP-2对肺癌细胞上皮-间质转化的影响及其作用机制

王福琴

（山西医科大学晋祠学院，山西太原 030025）

目前，肺癌发病机制仍未明确，临床多经手术、放化疗治疗，但术后癌细胞侵袭性转移、复发仍是影响肺癌患者死亡的重要原因[1]。因此，探寻肺癌细胞侵袭、转移发生机制至关重要。而包括肺癌在内的多种肿瘤细胞侵袭、转移与上皮-间质转化有较大关联。研究发现，肺癌组织中BMP-2特异性升高，可判断预后[2]。骨形态发生蛋白（BMPs）是转化生长因子-β超家族成员，可刺激骨细胞分化。骨形态发生蛋白-2（BMP-2）为BMPs最具代表性因子，可促进骨修复，抑制肿瘤细胞生长。但临床就其BMP-2对肺癌细胞上皮-间质转化影响的研究仍较少。

1 材料与方法

1.1 实验材料

采用中国科学院上海细胞生物研究所提供的肺腺癌细胞系A549，取自12例手术切除肺腺癌组织新鲜标本，其中男8例、女4例；年龄41～75（60.05±1.55）岁。仪器包括美国Beckman公司高速低温离心机、美国Forma Scientific公司细胞培养箱、日立公司7000型自动生化分析仪、美国BD公司Matrigel侵袭小室24孔培养板等。试剂包括Bioscience公司流式细胞检测试剂盒、美国R&D公司BMP-2（质量浓度1 mg/mL）、美国Cell Signaling公司鼠抗人E-cad单克隆抗体、美国Invitrogen公司DMEM高糖培养液、链霉素、青霉素等。

1.2 方法

1.2.1 BMP-2对A549细胞上皮-间质转化、侵袭、凋亡影响检测

1.2.1.1 实验分组

人肺腺癌A549细胞以青霉素、10%胎牛血清、链霉素制成的DMEM培养液培养；均处于对数生长期、生长良好。随机分为A组（空白对照）、B组（10 μg/mL BMP-2处理24 h）、C组（50 μg/mL BMP-2处理24 h）、D组（100μg/mL BMP-2处理24 h），各3例。

1.2.1.2 细胞上皮-间质转化实验

经免疫组织化学SP法检测E-cad表达：SP法行E-cad蛋白染色，加入一抗，4 ℃下孵育，过夜；PBS液洗涤，3次；加入二抗，37 ℃下孵育，30 min；DAB显色，10 min；染色、脱水、透明，中性树胶封固。阳性标准为细胞质呈棕黄色颗粒着色。400倍光学显微镜下检测E-cad表达强度，每个点阵计数1 000个肿瘤细胞。阳性（++）为E-cad阳性细胞≥90%，弱阳性（+）为10%～90%，阴性（-）为＜10%或完全消失。

蛋白质印迹法检测：200 μL RIPA裂解液裂解细胞，提取蛋白，100 ℃下煮沸，5 min，混合蛋白加样缓冲液，10% SDS-PAGE分离蛋白。室温下封闭2 h，加入一抗、vimentin、BMP-2、β-actin单克隆抗体，4 ℃下过夜。缓冲液洗膜，3次，加入二抗，室温孵育，1 h。缓冲液洗膜，3次，加增强化学发光试剂，室温孵育，3 min。暗室曝光，30 s～5 min，显影，定影，成像。目的条带以IPP软件行灰度分析。

1.2.1.3 细胞侵袭实验

B、C、D组以胰蛋白酶消化细胞，离心，置于无血清DMEM培养液，细胞密度5×105/个。24孔培养板中置入Matrigel侵袭小室，以含10%胎牛血清DMEM培养液500 μL加入下室，以细胞悬液200 μL加入上室，培养24 h。PBS液洗涤，3次；37 ℃下，以4%多聚甲醛溶液固定细胞，30 min；PBS液洗涤，3次；小室内面Matrigel基质胶以棉签清除干净，细胞核染色，置于载玻片，200倍荧光显微镜下观察。分别取每张膜上、下、左、右、中部视野计数穿膜细胞数，检测3次，取平均值。

1.2.1.4 细胞凋亡实验

6孔培养板内，以1×106个/mL密度接种A549细胞。B、C、D组各设置3个平行孔。作用24 h后，收集细胞，离心，PBS液洗涤，2次；结合液重悬蛋白、Annexin V-FITC避光孵育，15 min；离心，沉淀。流式细胞仪检测细胞凋亡率，检测3次，取平均值。

1.2.2 BMP-2促进A549细胞上皮-间质转化、凋亡中p38 MAPK信号作用

实验分组：进入对数生长期细胞中加入100 μg/mL BMP-2处理24 h，设为E组；E组基础上再加终质量浓度10 μmol/L的sb203580处理细胞24 h，设为F组。分别经免疫组织化学法、FCM法等检测p38 MAPK信号通路对BMP-2诱导A549细胞上皮-间质转化、侵袭、凋亡的影响，方法同1.2.1。

1.3 统计处理

数据以GraphPad Prism 5软件分析。计量资料以（±s）表示，以t检验对比。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 BMP-2对A549细胞上皮-间质转化影响

B、C、D组细胞质内E-cad表达强度呈浓度依赖性降低，见图1。C组、D组BMP-2表达水平高于A组（P＜0.05），D组vimentin水平高于A组（P＜0.05），见表1。

图1 四组细胞质内E-cad表达强度

表1 四组E-cad、vimentin水平对比（±s，μg/mL）

表1 四组E-cad、vimentin水平对比（±s，μg/mL）

组别E-cadvimentin A组0.45±0.050.22±0.02 B组0.38±0.040.23±0.03 C组0.19±0.040.25±0.05 D组0.15±0.030.38±0.05

2.2 BMP-2对肺癌A549细胞侵袭、凋亡的影响

B、C、D组穿过滤泡细胞数多于A组，细胞早期凋亡率低于A组（P＜0.05），见表2。

表2 四组穿过滤泡细胞数、早期凋亡率对比（±s）

表2 四组穿过滤泡细胞数、早期凋亡率对比（±s）

组别穿过滤泡细胞数/个细胞早期凋亡率/%A组45.28±18.605.14±2.05 B组114.35±14.681.62±0.55 C组212.48±14.851.31±0.35 D组315.26±30.480.98±0.48

2.3 BMP-2促进A549细胞上皮-间质转化中p38 MAPK信号作用

F组细胞质内E-cad表达高于E组，如图2。F组E-cad表达水平高于E组，vimentin表达水平低于E组（P＜0.05），如表3。

图2 两组细胞质内E-cad表达强度

表3 两组E-cad、vimentin水平对比（±s，μg/mL）

表3 两组E-cad、vimentin水平对比（±s，μg/mL）

组别E-cadvimentin E组0.20±0.100.51±0.10 F组0.31±0.110.39±0.08

2.4 BMP-2促进A549细胞侵袭、凋亡中p38 MAPK信号作用

F组穿过滤泡细胞数少于E组，细胞早期凋亡率高于E组（P＜0.05），见表4。

表4 两组穿过滤泡细胞数、早期凋亡率对比（±s）

表4 两组穿过滤泡细胞数、早期凋亡率对比（±s）

组别穿过滤泡细胞数/个细胞早期凋亡率/%E组305.48±45.600.89±0.45 F组155.65±23.051.54±0.78

3 讨论

目前认为，肺癌形成是一个多因素、多步骤过程，具体发病机制尚不清楚，诱发机体死亡重要原因之一为肿瘤细胞侵袭、转移[3]。BMP信号通路与肿瘤进展密切相关，抑制BMP受体表达可阻断BMP信号通路，控制肿瘤细胞生长分化[4]。上皮-间质转化即特定生理、病理状况下上皮细胞向间充质细胞转化现象，可致使肿瘤细胞转变为具有较强运动能力“间质样”细胞，且可侵入周围组织间隙、脉管系统，引发肿瘤侵袭、转移。而肺癌细胞上皮-间质转化由多种细胞因子参与，如BMP-2等。BMP-2能参与调控多种基因生理活性，可引发细胞增殖、凋亡，且在组织修复、再生中作用显著。研究发现乳腺癌细胞中存在BMP-2高表达，且参与肿瘤发生、发展[5]。但临床就肺癌细胞中BMP-2表达的研究仍较少。

机体正常上皮细胞完整性维持中，E-cad蛋白意义显著，该蛋白属于上皮细胞表型特征蛋白，广泛参与细胞间连接。本研究中，B、C、D组细胞质内均存在E-cad表达，且强度呈浓度依赖性降低。而E-cad表达下降，可反映上皮细胞特征的丢失。Vimentin是一种细胞骨架蛋白，在正常上皮细胞中不表达，但可在间质细胞中广泛存在，如巨噬细胞、内皮细胞等，是上皮-间质转化的一个重要因素。本研究中，随着BMP-2浓度的提升，肺癌细胞内vimentin呈浓度依赖性增加。提示BMP-2可促使肺癌细胞向间质细胞转化，诱导出现上皮-间质转化。此外，B、C、D组穿过滤泡细胞数较A组多，且三组呈递增趋势，推测BMP-2可提升A549细胞侵袭能力。细胞凋亡为肿瘤转移调控一个重要机制。但临床针对肺癌细胞出现上皮-间质转化后是否影响细胞凋亡能力仍存在较大争议。本次研究中，B、C、D组细胞早期凋亡率均较A组低，三组呈递减趋势，分析可能与所选细胞株本身凋亡率偏低有关，而BMP-2可抑制A549细胞早期凋亡，且增强侵袭能力。

本研究还分析了BMP-2促进A549细胞上皮-间质转化中p38 MAPK信号的作用。p38 MAPK是一种细胞信号转导途径，在肿瘤细胞出现上皮-间质转化中发挥重要作用，且可影响多种肿瘤细胞侵袭、转移。研究发现，p38 MAPK特异性抑制剂SB203580能激活caspase-8启动外源性凋亡途径，诱导细胞凋亡[6]。本研究中，F组E-cad表达水平较E组高，vimentin水平较E组低，提示p38 MAPK通路抑制剂能调控部分BMP-2诱导肺癌A549细胞上皮-间质转化。F组穿过滤泡细胞数少于E组，早期凋亡率高于E组，故推测p38 MAPK通路抑制剂能对BMP-2诱导肺癌A549细胞侵袭能力进行抑制，并逆转BMP-2诱导A549细胞早期凋亡。但考虑到肺癌细胞上皮-间质转化的发生与多种复杂信号通路有关，并非由单因素决定，故今后仍需进行更深层次分析。

综上所述，肺癌细胞上皮-间质转化发生中BMP-2作用显著，可经由激活p38 MAPK信号通路调控，从而促使细胞侵袭能力增强，抑制细胞凋亡。