QuEChERS结合UPLC-MS/MS同时测定玫瑰花中19种农药残留

陈丽娜，秦瑶，孙成丹，王晶，刘春明*

（1.长春师范大学，吉林长春130032；2.北京知蜂堂健康科技股份有限公司，北京 102200）

玫瑰花含有丰富鞣质、原花青素、黄酮、维生素C及人体所需的多种氨基酸和微量元素[1-4]，具有通经活血、美容养颜等功效，被作为花茶和食材广泛使用。随着人们对食用玫瑰花需求的增加，栽培面积越来越大。玫瑰花栽培过程中常见锈病、黑莓病、白粉病等疾病以及玫瑰茎叶蜂、玫瑰中夜蛾、吹绵蚧及红蜘蛛等害虫[5-6]，因此需适当喷洒农药已进行预防和治疗。但如果使用不合理，任意加大农药的喷施浓度或施药后未按安全间隔期采收，都会造成农药残留污染问题[7-8]。

液相色谱-串联质谱技术由于具有灵敏度高、抗干扰能力强等优点成为农药残留检测的主要工具之一。超高效液相色谱-串联质谱技术在此基础上进一步缩短了分析时间，提高了工作效率[9]。QuEChERS方法是一种集提取与净化为一体的样品前处理方法，在农产品的农残分析中具有很好的应用前景[10]。

本实验对QuEChERS进行了适当改进，研究了应用UPLC-MS/MS分析玫瑰花中19种常用农药残留的测定方法。并应用此方法对实际样品进行了分析，获得了较好的分析结果。

1 实验部分

1.1 药品与试剂

玫瑰花样品，购买于长春中东万家大药房。UPLC所用的流动相乙腈（色谱纯，Fisher，美国），甲酸、乙酸（色谱纯, 阿拉丁）；N-丙基乙二胺（PSA）、C18与石墨化碳粉末（GCB），均购于Agela公司；氯化钠（NaCl）、无水硫酸镁（MgSO4）、乙酸铵（NH4OAc）、乙酸钠（NaAc）为分析纯购自北京化工厂，NaCl于120 ℃条件下在马弗炉中加热5 h，无水MgSO4在650 ℃条件下加热4 h；农药标准物质的纯度＞95%，均购自于Dr.EhrenstorferGmbH公司；实验用水为超纯水。

1.2 实验仪器

UPLC-MS/MS（ACQUITY UPLC, Xevo TQ-S,Waters公司），配有ESI离子源，三级四极杆质量分析器；Acquity UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司）；离心机（3K30，Sigma公司）；涡旋混合器（QiLinBeier5，科学仪器厂）；氮气吹干仪（YGC-24，郑州宝晶公司），超纯水制备仪（LabostarTMTWT UV7，SIEMENS公司）。

1.3 UPLC-MS/MS分析条件

利用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50mm×2.1 mm，1.7 μm）分离；流动相A为乙腈，流动相B为0.01%甲酸水溶液，采用梯度洗脱程序：0～3.0 min，10%～30% A；3.0～6.0 min，30%～50% A；6.0～6.5 min，50%～80% A；6.5～7.5 min，80%～95% A；7.5～9.0 min，95%～95% A；9.0～10.0 min，95%～10% A；10.0～12.0 min，10%～10%A。流速：0.3 mL/min；柱温：30℃；进样体积：5.0 μL。

UPLC系统配有三级四极杆质谱，离子源为电喷雾电离离子源（ESI），正离子扫描，多反应离子监测模式（MRM）进行分析，质谱操作参数如下：毛细管电压1.0 kV，离子源温度120℃，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气流量700 L/h，锥孔气流量150 L/h，碰撞气流量0.15 L/h。

1.4 样品的前处理方法

称取2 g玫瑰花样品于50 mL的离心管中，并向其中加入10 mL的超纯水及10 mL含有0.1%乙酸的乙腈，涡旋混匀1 min；称取4 g无水MgSO4和1g NaCl，将其加入至离心管中，涡旋混匀1 min，在3500 r/min条件下离心5min。取2 mL的上层提取液加入至含有300 mg无水MgSO4、100 mgPSA及20 mgGCB混合物的10 mL离心管中，涡旋混匀1 min，在3500 r/min条件下离心5 min。取2 mL的提取液在30℃条件下氮吹至近干，用乙腈∶水（v/v，1∶9）溶液定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，待测。

2 结果与分析

2.1 UPLC-MS/MS条件的优化

首先以超纯水作为水相，分别考察乙腈和甲醇作为有机相的分离效果。甲醇作为有机相时，化合物的峰形普遍较宽，且化合物的灵敏度相对乙腈低，因此选用乙腈作为有机相。但在乙腈-纯水系统下，烯啶虫胺与吡蚜酮的色谱峰形较宽且灵敏度较低，而向水中添加0.01%甲酸后色谱峰形得到改善。因此，最终的流动相为乙腈-0.01%甲酸水溶液，同时对洗脱程序进行了优化，色谱图见图1。

然后以乙腈∶水（v/v，1∶1）溶液稀释农药标准品溶液，直接注入质谱中进行质谱条件优化。在ESI+模式下，分别采用全扫描和子离子扫描方式优化得到各个化合物的母离子、子离子、锥孔电压以及碰撞能。其中，丰度比较高的子离子作为定量离子，丰度相对较弱的子离子作为定性离子。质谱条件见表1。

图1 19个化合物的总离子流图

表1 19种农药的色谱及质谱条件

2.2 前处理方法的优化

2.2.1 提取溶剂的优化

常规的QuEChERS方法使用乙腈作为提取溶剂提取样品中的多种农药残留。由于PSA含有碱性基团，会导致部分农药的回收率降低，因此本文考虑向乙腈中添加少量乙酸以提高回收率。

分别考察了乙腈、含有0.1%乙酸的乙腈、含有1%乙酸的乙腈3种提取溶剂的提取效率，见图2。当选用乙腈为提取溶剂时，烯啶虫胺的回收率仅为6.5%，而1%乙酸乙腈为提取溶剂时，烯啶虫胺和克百威的回收率同样也不能满足分析要求，二者回收率分别为36.3%和52.8%。含有0.1%乙酸的乙腈提取待测农药时，19种农药的回收率均在82.3%～101.6%，故选用含有0.1%乙酸的乙腈为提取溶剂。

2.2.2 混合盐的优化

实验考察了3种混合盐的净化效果及对回收率的影响，分别为：（1）无水MgSO4+NaCl；（2）无水MgSO4+NH4OAc；（3）无水MgSO4+NaAc。实验结果见图3，当使用第3组混合盐时，丁硫克百威的回收率仅为54.3%；选用第1或第2组混合盐时，农药的回收率均满足分析要求且两组之间的数值大小并无较大差别，但在实际操作中使用第1组混合盐时，溶液的分层效果更佳，农药的回收率在89.8%～101.3%，因此选择无水硫酸镁和氯化钠为混合盐。

2.2.3 净化剂的优化

根据基质样品中所含杂质的特点对使用净化剂的种类进行优化，考虑到玫瑰花样品基质的提取液比较干净，因此减少了PSA的使用量。比较了每1 mL玫瑰花提取液添加不同质量的PSA时化合物的回收率变化情况。当添加50 mg的PSA时，各个化合物的回收率最高，因此每1 mL的玫瑰花提取液添加50 mg的PSA，见图4。

由于不能准确判断玫瑰花中脂肪类物质的含量，考察了玫瑰花提取液是否需要添加C18进行净化，见图5。实验表明，添加C18净化后各个化合物的回收率相对降低，吡蚜酮的回收率更低至11.2%，净化液颜色并未出现明显的变化，因此不添加C18。

图2 不同提取溶剂的回收率（%，n=5）

图3 不同混合盐的回收率（%，n=5）

图4 不同质量的PSA的回收率（%，n=5）

图5 不同净化剂时农药的回收率（%, n=5）

2.3 基质效应

分别用空白基质提取液和乙腈∶水（v/v，1∶9）溶剂配制农药的基质校准溶液和标准溶液，以各化合物的峰面积对标准系列浓度绘制基质校准曲线及溶剂标准曲线。基质效应（ME）数值用基质标准曲线的斜率与溶剂标准曲线斜率之比计算，结果见表3。玫瑰花中只有吡蚜酮存在基质增强效应，其他均为基质抑制效应。因此通过基质校准曲线对定量结果进行校正，增加定量结果的准确性。

2.4 定量限与检出限

用空白基质提取溶液将农药混合标准储备液逐级稀释，制备混合系列标准溶液，以各组分峰面积（y）对浓度（x）绘制标准曲线。在优化的实验条件下，信噪比（S/N）大于10时，各化合物的定量离子对对应的样品浓度计算定量限（LOQ）；以信噪比（S/N）大于3时，各化合物的定量离子对对应的样品浓度计算检出限（LOD）。线性方程、r2、LOQ、LOD见表3，多种农药在1～100 μg/kg浓度范围内线性关系良好，LOD在0.023～0.26 μg/kg，LOQ在0.078～0.870μg/kg。

2.5 回收率与精密度

选取不含农药的玫瑰花样品，利用1.4优化后的方法处理，设定3个不同浓度的添加水平（1、5、10 μg/kg），进行加标回收率实验，每个水平平行测定5次，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表4。19种农药的回收率在77.8%～110.9%，RSDr为1.1%～14.7%，RSDR为2.5%～17.6%。

表3 19种农药的线性方程、R2、ME、LOD、LOQ

表4 19种农药的加标回收率和相对标准偏差

2.6 实际样品测定

在市场购买3份玫瑰花样品，进行检测。啶虫脒在3份样品中均有检出，其中1份样品的啶虫脒含量为0.39 μg/kg，其余2份的含量低于定量限。除此之外，在另一份样品中多菌灵和吡虫啉也有检出，含量分别为0.17 μg/kg和0.93 μg/kg，其他农药未有检出。

3 小结

本研究建立了同时检测玫瑰花中19种农药残留的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法。该方法采用0.1%乙酸乙腈提取待测农药，经无水MgSO4和NaCl混合盐分离后，以PSA和GCB对提取液进行净化。实验对所建立的方法进行方法学考察，包括基质效应、定量限、检出限、回收率及精密度。结果表明，该方法的回收率在77.8%～110.9%，RSD≤17.6%，符合欧盟检测标准（回收率在70%～120%，RSD＜20%）。所建立的方法灵敏度高、重现性好，可对待测农药进行准确的定性定量分析，节省分析时间，在花类中药材的农药残留分析检测中有极大的应用发展空间。