海藻糖脂的合成及应用前景

张博涵，沈新乐，胡 燚，唐苏苏

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏南京211800； 2.南京工业大学药学院，江苏南京211800)

海藻糖脂(trehalose lipids,trehalolipids)是一类具有表面活性的化合物，由亲水和疏水两部分组成，亲水部分是海藻糖，疏水部分主要是脂肪酸[1]。自然界中，海藻糖脂主要分布于革兰氏阳性、高GC含量的放线菌中，如分枝杆菌(Mycobacteria)、诺卡氏菌(Nocardia)、红球菌(Rhodococcus)和棒状杆菌(Corynebacteria)[2-5]。其中，海藻糖-6,6′-二霉菌酸脂(TDM)、海藻糖-6-霉菌酸脂(TMM)和琥珀酰海藻糖脂(STL)最常见，前两者结构见图1和2。海藻糖脂是一类生物表面活性剂，与化学表面活性剂相比，具有低毒性、高稳定性、耐酸耐盐性、生物可降解、环境友好及抗菌性等优势。和其他糖脂一样，海藻糖脂的研究工作已历经几十年，但尚未进行大规模生产及应用，主要原因是生产成本高、产量低和产品结构多变等。本文中，笔者将对海藻糖脂的合成方法及应用价值进行概述和探讨。

图1 海藻糖-6,6′-二霉菌酸脂和海藻糖-6-霉菌酸脂Fig.1 Trehalose 6,6′-dimycolate and trehalose-6-monomycolate

图2 琥珀酰海藻糖脂Fig.2 Succinoyltrehalose lipid

1 合成方法

1.1 化学合成法

海藻糖脂的传统合成途径是化学合成。由于糖环上的羟基众多，反应过程中会伴有副产物产生。为避免这一现象，主要采取的合成策略有两种，一种是使用保护基团保护海藻糖的伯羟基不被苄基化，随后去除保护基团并进行酰化作用[6-10]；另一种是选择性地将海藻糖的一部分伯羟基转化为硫酸盐或卤化物，通过SN2取代反应，使用羧酸盐为酰基供体，获得目的产物[11-12]。上述两种方法的缺点在于反应步骤繁琐，反应时间长且成本昂贵，因此不利于推广和应用。不过，对于结构相对简单的海藻糖单脂和二脂，其合成过程相对简单。Paul等[13]使用O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)催化海藻糖，分别与己酸、棕榈酸和油酸在室温下反应获得海藻糖脂。当脂肪酸轻微过量时，产物中海藻糖单脂的占比可达65%～69%，当脂肪酸与海藻糖摩尔比大于2时，海藻糖二脂的占比为63%～70%，且海藻糖脂反应时间随脂肪酸链链长增加而增加。图3为化学合成海藻糖脂的示意图。

图3 化学法催化合成海藻糖单脂和海藻糖二脂Fig.3 Chemical synthesis of trehalose mono- and di-esters

1.2 生物合成法

1.2.1 全细胞合成法

全细胞合成法又称微生物发酵法，是利用细胞中的多酶联合催化获得目标产物的方法，通过工业发酵可实现大规模生产，其生产水平主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件。人们对于海藻糖脂生产菌的研究已有几十年之久，研究工作最为广泛的是红球菌(Rhodococcus)。表1中列举了几类海藻糖脂及其生产菌。为了满足海藻糖脂的商业化应用条件，首先应采取的经济策略是降低成本。用于微生物发酵的培养基是决定能否用于产业化生产的决定因素之一，通常占生物表面活性剂生产成本的50%，所以理想的方案是用廉价的原料获得最多的产品。另外，还可以通过对表面活性剂生产菌株的结构改造获得高产菌种。

表1 海藻糖脂生产菌及其主要产物类型

1)营养条件优化。目前的研究表明，大部分海藻糖脂生产菌以正烷烃为主要碳源，且烷烃的种类影响产物中海藻糖脂的化学结构。当烷烃的碳链长为C14～C16，特别是正十六烷时，海藻糖脂产率最高[16]，图4为RhodococcuserythropolisDSM 43215的海藻糖脂生物合成途径[22]。虽然正烷烃是公认的最佳碳源，可以保证菌体的生长和海藻糖脂的合成，但其价格昂贵。因此，有必要寻找一类价格低廉的替代原料。目前的研究证明：植物油[23]、厨余垃圾[24]、农业废料和食品轻工废料均可作为原料替代物培养微生物生产生物表面活性剂。Espuny等[25-26]使用烷烃和废润滑油混合物作为唯一碳源，培养Rhodococcussp. 51T7，所得海藻糖脂产量为0.48～1.12 g/L。随后该团队又对该菌培养基进行优化，优化后NaNO3、K3PO4和Fe2(SO4)3的质量浓度分别为2.5、1.5和0.01 g/L，最终海藻糖脂的产量增加至3 g/L。何海洋等[27]用食用油替代十六烷作为Dietziacinnamea7517d的碳源，优化后产量达756.4 mg/L，较发酵基础培养基提高了9.4倍，该文献中作为发酵培养基碳源的食用油价格为14.8元/L，仅为正十六烷价格的0.5%。

图4 Rhodococcus erythropolis DSM 43215中的海藻糖-6,6′-棒杆菌分枝菌酸二酯的合成途径Fig.4 Trehalose dicorynomycolate synthesis pathway from n-tetradecane by Rhodococcus erythropolis DSM 43215

2)培养条件优化。发酵过程是生产过程中重要的一环，通过优化底物的配比可控制微生物细胞达到适宜菌体量，从而使海藻糖脂达到最大积累量。Uchida等[28]研究发现R.erythropolisSD-74在pH 7.0、高磷酸缓冲液浓度(0.3～0.4 mol/L)、高渗透压(2%NaCl)条件下能使海藻糖脂产量提高，发酵10 d后产量可达40 g/L。Mutalik等[29]使用响应面分析法改进了Rhodococcusspp.MTCC 2574的发酵过程，优化后含海藻糖脂的表面活性剂混合物产量由3.2 g/L提高到10.9 g/L。

3)高产微生物的筛选与重组。除了对外部因素的优化，微生物菌种的遗传特性也是决定高效发酵生产的重要因素。通过诱变育种和基因工程技术获得海藻糖脂高产微生物菌株是提高工业生产水平的关键。Inaba等[30]对生产STL的Rhodococcussp. SD-74的合成途径进行了分析，研究发现STL合成途径与3种基因密切相关，并对其中的酰基辅酶A转移酶基因tlsA进行过表达，改造后菌种的STL产量相比之前提高了2倍。Dogan等[31]将透明颤菌中的血红蛋白基因插入到污泥戈登氏菌(Gordoniaamarae)中，提高了菌体的生长和海藻糖脂的合成，结果显示海藻糖脂产量约为80 mg/L，提高了4倍左右。

国内外对于生物表面活性剂的全细胞合成研究工作已有数十年之久，但针对海藻糖脂的工业化生产研究还处于初级阶段。培养基中碳源的成本是海藻糖脂生产成本高居不下的主要原因，目前对于海藻糖脂生产菌的碳源替代物的研究尚不成熟，不足以支撑微生物合成海藻糖脂的工业化应用。日后的研究工作应加强这方面的研究，并引入诱导等调控机制，降低海藻糖脂的生产成本并提高产量。

1.2.2 酶促合成法

酶促合成法是近年研究的热点，它具有催化效率高、反应条件温和、反应专一性强，副反应少及产物容易分离纯化等特点，但酶制剂的价格昂贵。从反应机理考察，合成糖脂的反应类型主要分为两类，即酯化反应和转酯化反应。酯化反应是利用酶催化糖和脂肪酸发生酯化反应得到对应的酯；转酯化反应是利用酶催化糖和一些简单的酯反应，得到对应的糖脂。由于热力学限制，糖脂合成反应不适宜在水相中进行。事实上，酶分子表面需要接触少量的水分子才能够维持具有催化活性所必需的构象。因此，非水相介质并不是严格意义上的无水，而是含有极少量的水，换句话说，其实是微观上的微水相反应。

1)有机溶剂体系。有机溶剂作为介质的酶催化反应是近年来研究最多的体系，它操作简单，反应条件温和且易于控制。催化合成海藻糖脂的酶包括脂肪酶和蛋白酶。这些酶对海藻糖的C6-OH有区域选择性。由于海藻糖脂的对称结构，在反应物充足的情况下，脂肪酶如Novozym 435倾向于催化合成海藻糖二脂[32]；来源于枯草芽孢杆菌属的蛋白酶能在极性较强的有机介质中催化合成海藻糖单脂[33]。鉴于海藻糖脂是极性有机物，为保证其溶解效果，溶剂需具有一定极性，但溶剂的极性过强会降低长链脂肪酸的溶解效果和导致脂肪酶失活[34]。因此，寻找一种合适的有机介质体系是整个反应的关键所在。强极性溶剂中加入弱极性溶剂能促进反应物溶解、维持酶活，还能影响产物中糖脂的类型。Hsieh等[35]以体积比4∶ 1的DMSO/叔戊醇混合溶液为介质，用Novozym 435催化海藻糖和硫辛酸的酯化反应，底物摩尔比1∶ 4，温度40 ℃，反应4 d后得到的产物为6-海藻糖硫辛酸酯，转化率为(75.9±1.9)%。此外，底物的摩尔比也会影响产物组成。Woudenberg等[32]以叔丁醇为溶剂，南极假丝酵母脂肪酶为催化剂，分别研究了海藻糖与丁酸乙脂和十二酸乙酯的酯交换反应，结果表明底物中酯/糖的摩尔比越大，产物中的二酯/单酯转化率之比就越高。丁酸乙脂和十二酸乙酯与海藻糖的摩尔比为48.5时，产物中海藻糖二酯/单酯的转化率之比分别为72/12和80/3。

2)无溶剂体系。与传统有机溶剂反应体系相比，无溶剂体系以纯底物作为溶剂，底物浓度高、反应速度快、产品得率高，又因避免使用(或少量使用)有机介质，有效地减少了后处理步骤，既降低生产成本，又减少环境污染，适于产品的大批量生产。基于上述优势，无溶剂体系中脂肪酶催化研究越来越受到青睐。铁翠娟等[36]以吸附在硅藻土上的假丝酵母脂肪酶为催化剂，在无溶剂体系中合成海藻糖6,6′-二月桂酸酯，温度47 ℃、pH 7.0、月桂酸与海藻糖的摩尔比大于6时，酯化反应的转化率较高，反应36 h转化率达95 %以上，产物纯度为90%～95%。

除上述2种技术外，还有一些最新的技术如离子液体技术尚未用于海藻糖脂的合成研究，具有研究价值。目前为止，大部分实验室和工业生产制备糖脂，还停留在化学合成阶段，与之相比，酶促合成法为高效、高区域选择性地合成糖酯类化合物提供了一条行之有效的途径，大幅度提高糖脂的转化效率并降低分离纯化成本。另外，与微生物方法相比较，酶促合成可以从糖类和脂肪酸等价廉易得的原料出发合成酯化位置特定的糖脂，产物单一、副产物少，但其缺点是酶的成本较高，而且酶法合成的表面活性剂多是一些结构相对简单的分子。但对于特殊结构的海藻糖脂，仍需要借助另外两种技术，限制了酶法合成的工业化应用。

2 应用前景

2.1 生物医学领域的应用

2.1.1 抗菌和抗病毒活性

糖脂类生物表面活性剂可以溶解细菌的细胞壁，所以具有一定的抗菌活性。由于细菌细胞壁组成及结构的差异，海藻糖脂对革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌有更显著的抑制作用[37]。其作用机理可能与脂肪酸破坏微生物的细胞结构，导致细胞内容物流出，或扰乱了与生物膜相关的呼吸链电子传递系统有关。海藻糖脂在质量浓度为300 mg/L时，能够抑制丝状真菌分生孢子萌发[38]。有研究发现STL在质量浓度为11～33 mg/L时，能够抑制单纯疱疹病毒和流感病毒繁殖[28,39]。

2.1.2 免疫学活性

海藻糖脂在免疫学方面的研究已经进行了几十年之久[5,21,40]。其中最早被发现具有抗肿瘤活性的是海藻糖二霉菌酸醋(TDM)[41]，它能刺激早期体液和细胞免疫，诱导产生趋化因子(如，MCP-1、MIP-1α、IL-8)和细胞因子(如，IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10)。海藻糖二山嵛酸脂(TDB)及其类似物，可用作阳离子脂质体佐剂，辅助疫苗引起细胞免疫，刺激CD4+T细胞应答。CAF01(cationic adjuvant formulation)是一种基于表面活性剂二甲基双十八烷基铵(DDA)溴化物和TDB的阳离子脂质体佐剂。经一期临床试验，CAF01与重组肺结核融合抗原Ag85B-ESAT6 (NCT 编号：NCT00922363)、HIV-1缩氨酸混合物(NCT 编号：NCT01141205、NCT01009762)结合后安全性和稳定性良好[42-43]。基于海藻糖脂与免疫细胞分子的作用机制，人们未来将有可能研发出针对癌症和一些免疫防御疾病的新型免疫疗法。在其他领域的应用中，限制糖脂类生物表面活性剂应用的最主要因素是它们的生产和下游处理的成本过高。然而在医药领域，成本并不是首要的考察标准，因此，海藻糖脂在这方面的开发潜力非常之大。

2.2 食品领域的应用

糖脂类化合物因其高度的安全性和良好的表面活性等优点，已相继被联合国粮食及农业组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)、欧盟、美国、日本和中国等组织和国家批准作为食品添加剂。海藻糖脂的抑菌作用可用于食品防腐剂。张庆等[44-46]研发出一种新型食品防腐剂，主要成分是富马酸海藻糖甲酯(TMF)，具有高的抗菌活性及防霉性能。TMF抑菌谱广，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、牛奶酸败混合菌、啤酒酵母和面包酵母等常见微生物的生长有良好的抑制作用，其最低抑菌浓度(MIC)分别为0.08、0.07、0.07、0.06、0.04和0.03，并且可在pH 3～9范围内保持良好的抗菌活性；对混合菌群的抑菌能力优于富马酸单甲酯(MMF)，接近苯甲酸，还对油脂具有一定的抗氧化能力。

2.3 化妆品领域的应用

海藻糖脂具有良好的乳化性、分散性、增溶性等性能，能使油脂、药物成分及化妆品其他成分分散稳定，因此适合作为化妆品的乳化剂和乳化稳定剂。日清奥利友集团研制出一种海藻糖脂组合物，其热稳定性优异、对各种蜡具有优异的硬度调整作用，相对于各种化妆品，可与蜡一起作为固形剂使用，且可赋予配合的化妆品优异的保型性和良好的使用感及妆的持久性[47]。

2.4 生物修复领域的应用

工业生产中排放的疏水性有机化合物很容易与土壤颗粒结合，从而导致可溶性降低，如何有效地处理这类化合物已经成为一大难题。海藻糖脂等生物表面活性剂能提高有机化合物的溶解度，使污染物分散、增溶和乳化，进而促进污染物尽快地降解。从污染地区土壤中筛选出最多的海藻糖脂生产菌是红球菌，可应用于修复污染土壤[48-49]，研究表明，由铜绿假单胞菌合成的海藻糖脂使阿拉斯加原油污染物的降解率大大提高，30 ℃时其驱油效果是水的2～3倍。

2.5 石油工业领域的应用

海藻糖脂可降低原油与水两相的界面张力，从而提高油田的开采量。Wintershall公司在北海油田进行提高原油采收率试验，质量浓度为50 mg/L的海藻糖脂能让驱油效果提高30%，与一般化学表面活性剂相比，驱油效果增大了5倍。目前化学合成表面活性剂在油田生产中已经得到稳定应用，但对于生物表面活性剂驱油机制的认识仍处于摸索阶段，其驱油活性和无害可回收等性质成为未来的技术发展方向[51]。在石油工业和生物修复领域，不需要严格控制海藻糖脂的纯度和毒性，因此分离纯化成本低，但是对产量和生产成本的要求较高。所以，对于大规模推广应用还需深入研究。

3 结论与展望

近十年来，海藻糖脂的研究与发展步入了新的阶段。如今人们已发现并分离了多种不同结构的海藻糖脂以及生产菌株。合成技术也从传统的化学合成逐渐转变为全细胞合成和酶法合成。研究证明，海藻糖脂在生物医学、食品、化妆品、环境修复和石油工业等领域具有广泛的潜在应用价值，其在生物医学领域的应用前景更是处于领先地位。糖脂生物表面活性剂具有其他表面活性剂无法比拟的优势，但是这些优势还不足以支撑大规模生产。为了像其他生物技术产品一样得到广泛应用，进行基础研究的同时还必须要考虑海藻糖脂可能带来的商业应用价值和效益。只有解决这些难题，与海藻糖脂有关的产品才会达到市场预期的要求，成为快捷、实惠、环保的生物表面活性剂。