EMS诱变三七种子获得抗衰老植株

周 璇, 韩 丽,戴 蕾,平翔蕊,蒋 丽,何霞红,杜云龙

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201； 2.云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南农业大学，云南 昆明 650201；3 云南农业大学 农业生物多样性与病害控制教育部重点实验室， 云南 昆明 650201)

三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H. Chen是五加科人参属植物，在我国属于传统名贵中药材。三七含有的三七皂苷等有效成分具有散瘀止血、消肿定痛的功效。据记载，三七在我国已有600 a以上的药用历史，驯化栽培历史已逾400 a[1～2]。但是，三七的人工种植受到环境条件、病害(立枯病、根腐病、圆斑病和疫病)、虫害(蚜虫、红蜘蛛和介壳虫)[3]和连作障碍的严重影响[4]。因此，上述因素造成了三七的种植条件要求较高、生产难度大、产量低。我们将通过化学诱变的方法筛选具有适应不同环境条件如低温的三七植株,为三七育种提供种质资源。化学诱变是筛选植物突变体的常用方法。化学诱变剂可分为烷化剂、碱基类似物和嵌入染料三大类[5]，常见的化学诱变剂有甲基磺酸乙酯(EMS)、叠氮化钠(NaN3)和平阳霉素(PYM)。EMS因其低成本，易操作，专一性高而成为应用普遍的诱变方法，无论是种子、愈伤组织、花粉及小孢子等均可作为诱变对象[6]。目前EMS作为常用和有效的化学诱变剂，已经被广泛应用于水稻、小麦、玉米、大豆[6]、油菜[7]、甜橙[8]及草莓[9]的育种。EMS烷化作用诱发的点突变或染色体缺失均能稳定地遗传给子代[10]，并且产生的突变体大多为显性突变体，方便田间观察[11]。EMS诱变突变植株的染色体畸变情况少，突变率高，在小麦中的突变概率为1/41.55 kb[12]，拟南芥为1/170 kb[13]。因此，利用EMS诱变方法，经过选育可以获得所需的植株表型。三七目前没有人工选育的品种，并且暂无研究者利用EMS等化学诱变的方法选育三七品种。在该项研究中，我们将选用不同浓度的EMS诱变三七种子，从而筛选一批表型发生明显变化以及具有抗衰老特征的三七突变体植株，为三七产业的发展提供种质资源；同时，也为使用EMS诱变技术开展中药材育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料与试剂

三七种子来源于云南文山三七市场。所用到的主要试剂有0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0)，0.06 mol·L-1PBS，0.3%、0.4%、0.5% 的EMS溶液。EMS溶液用1.2 mg·mL-1的EMS母液配制。

1.2 试验方法

1.2.1 EMS 诱变三七实验方法 将成熟的三七种子清洗干净，分别用0.06 mol·L-1PBS，0.3%、0.4%、0.5%的EMS诱变剂浸泡15 h。用5%硫代硫酸钠溶液对诱变三七种子的EMS溶液进行中和反应10 min 后，三七种子在流水下冲洗2 h，对种子进行子沙埋培养，待三七种子发芽后，将其种植在云南农业大学在 “三七现代农业研究和中试基地”。

1.2.2 抗衰老植株筛选 将EMS诱变处理后的三七种子种植三七大棚中，并同时种植经0.06 mol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS)处理的种子作为对照。经过4 a种植后，根据植株地上部分的枯萎状态筛选具有抗衰老特征的三七。

1.2.3 测定植物内源激素 对四年生的具有抗衰老特征的诱变三七的叶片进行取材，对照为同一时期种下的未经EMS诱变的野生型三七植株叶片。三七叶片称取量不低于200 mg，使用液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS/MS)测定内源激素的种类及含量。

2 结果与分析

2.1 EMS诱变三七种子的萌发率

采用0.3%、0.4%、0.5%三个浓度的EMS溶液处理三七种子，与PBS处理的对照组同时种在大棚内。0.3%EMS诱变的三七播种1 186颗，出苗449颗,出苗率37.9%；0.4%EMS诱变的三七播种1 180颗，出苗470颗，出苗率39.8%；0.5%EMS诱变的三七播种1 182颗，出苗438颗，出苗率37.1%，而对照组的出苗率为43%(图1)。因此，EMS溶液对三七种子的发育具有一定的抑制作用。

图1 EMS处理降低三七种子出苗率

2.2 EMS处理可影响三七植株表型

经EMS诱变处理后三七小苗种植于三七大棚内，生长2 a后，有些植株的表型发生变异，主要表现为：叶片明显变小变窄(图2B)、花型变小(图2C)、植株叶片发育不完全(图2D)。但是，发生上述表型变化的三七植株数量少，在生长过程中的存活率相比野生型低，这暗示上述突变对三七的生长是有害突变。

注：A：野生型植株， B：叶片变小变窄植株， C：花型变小植株， D：叶片发育不完全植株

2.3 EMS处理可获得抗衰老三七植株

EMS诱变后的三七植株种植4 a后，发现在冬季到来前，部分诱变三七与对照三七生长状态出现明显不同。在2017年11月3日观察时发现有3株EMS诱变三七的地上部分生长状态良好，种皮绿色或微红，未出现衰老现象(图3B)，而同期对照三七的叶片已经枯萎(图3A)。1个月后的跟踪观察发现对照三七地上部分几乎全部枯萎，茎杆倒伏(图3C)，但3株EMS诱变三七中的1株(EMS1)的叶片仍为绿色，种皮微红，另2株(EMS2,EMS3)的种皮红色，叶片开始变黄(图3D)。对照三七与EMS诱变三七生长于同一块大田中，其光照、温度、水分等环境条件均相同，但其抗衰老能力明显不同。因此，EMS诱变可以筛选到具有抗衰老能力的三七植株，从而增加三七对非生物胁迫的抗性。

注：A, B：植株观察于2017年11月3日；C, D：植株观察于2017年12月3日; CK是未经诱变的对照植株

图4 三七突变体内源激素含量

为了进一步分析EMS诱变三七的抗衰老机制，2017年11月3日我们对3株抗衰老三七(即EMS1/EMS2/EMS3)和同一块大田的对照三七进行叶片采样，检测叶片中植物激素水杨酸(SA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、茉莉酸-异亮氨酸(JA-Ile)的含量。在3株EMS诱变三七中，IAA的含量均明显升高(图4B)，但ABA的含量在EMS2株系中显著增加，而在EMS1株系中降低，在EMS3株系中与对照植株相比没明显变化(图4A)。对JA的含量测量后，发现EMS1和EMS2株系的茉莉酸含量明显升高，EMS3的含量没有发生明显变化(图4C)。而在JA-Ile的测量中，发现EMS1和EMS2株系的JA-Ile含量明显升高，EMS3株系的含量明显降低(图4D)。对SA含量进行测量后，发现EMS1株系中的水杨酸含量明显升高，而EMS2和EMS3株系中的水杨酸含量与对照植株相比没有明显的差别(图4E)。

3 讨论

三七是我国传统名贵中药，但长期以来，三七由于没有人工选育品种，导致三七在生产中面临许多问题[14]。在该项研究中，我们发现部分经EMS诱变的三七的花及叶的表型发生了明显的变异，部分EMS诱变的三七植株表现出抗衰老的能力。这显示利用EMS诱变技术，可以使三七产生丰富的遗传多样性，有利于选育性状优良的三七品种。利用EMS诱变的方法，在选育具有目标性状的植株上有着明显的作用。目前，在包括马铃薯、豇豆、金葵花等食用作物上都获得了性状优异的植株[15]。例如，甘蓝型油菜经EMS诱变的后代在子叶、叶片、花器、株型、角果和种皮这6个器官均发生了不同频率的突变[6]。在该项研究中，我们发现三七对EMS浓度具有依赖性(图1)。在获得的EMS突变体中，发现少量突变体的花及叶表型发生了有害突变(图2)，并且EMS诱变后三七出苗率降低，我们猜测EMS诱变对三七具有一定的致死效应。

植物激素对植物的生长发育起到非常重要的作用。在植物激素中，IAA可调控植物的生长发育[16]，脱落酸[17]、水杨酸与茉莉酸同植物的衰老密切相关[18～21]。当植物处于不良环境胁迫时，水杨酸会迅速在植物体内积累，减少不良环境对植物的影响[18]。在植物衰老过程中，水杨酸可以延缓蛋白质降解，达到减缓植物衰老的作用[19]。当植物受到水分、干旱、病原菌和昆虫胁迫时，体内的茉莉酸含量显著增加，以维持生长[20]。此外，茉莉酸和ERF转录因子也参与调控植物叶片衰老[21]。在我们所筛选的抗衰老三七突变体中，发现三七突变体EMS1, EMS2及EMS3植株的生长素含量都明显高于野生型(图4B)，这与植株的地上部分的生长状态相符合。但我们同时发现具有抗衰老能力的EMS1植株的ABA含量明显降低 (图4A)，同时伴随有水杨酸(图4E)、茉莉酸(图4C)和茉莉酸-异亮氨酸(图4D)含量的明显增加。这暗示在三七生长中，增加脱落酸的含量会促进三七的衰老。水杨酸在植物遭受干旱、寒冷、病原物入侵时会大量产生[22]，以保证植株健康生长[23]。EMS1株系中水杨酸含量最高，并且在三个抗衰老突变体EMS1， EMS2及EMS3植株中，地面部分最晚衰老(图3D)，水杨酸含量的升高可能有助于三七延缓衰老，这可能与水杨酸提高三七对低温的抵抗能力有关。有研究发现茉莉酸会通过抑制光合作用等机制促进植物衰老[24～25]。在EMS1突变体三七中，我们发现JA及JA-Ile的含量升高(图4C，D)，这暗示了水杨酸与ABA，JA及JA-Ile的相互作用对调控三七衰老过程起到重要作用，但是相关的机制还有待进一步深入研究。对抗衰老三七植株中的内源激素含量分析，有助于揭示三七在非生物胁迫条件如低温、干旱下生长的机制，从而有利于合理使用植物激素，促进三七产业的健康生长。

4 结论

通过EMS诱变的方法，我们获得一些表型发生变化的三七植株,包括叶片畸形，叶片发育不完全、花型小等。同时，初步筛选到具有抗衰老能力的三七突变体植株，其中水杨酸、生长素、脱落酸、茉莉酸和茉莉酸-异亮氨酸的相互作用对三七的正常生长起到非常重要的作用。