一测多评法测定山荷降脂粉中4种成分的含量

张娇 蒋倩倩 余婷婷 魏屹

[摘要] 目的 建立一測多评法测定山荷降脂粉中4种成分的含量的测定方法，并验证该方法的准确性和可行性。方法 采用高效液相色谱法测定山荷降脂粉中4种成分的含量，色谱柱：KromstarTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，流速：0.8 mL/min，柱温：25℃，芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的检测波长分别为330、354、375、363 nm，进样量10 μL。以槲皮素为内标物，建立槲皮素与芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、山奈酚的相对校正因子，并计算4种成分的含量，实现一测多评;同时采用外标法测定该4种成分的含量，比较计算值与实测值的差异，以验证一测多评法的准确性和可行性。 结果 芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的平均回收率分别为1.21%、1.08%、0.94%、1.33%，槲皮素与芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、山奈酚的平均相对校正因子分别为1.23%、0.53%、1.41%，3批山荷降脂粉中4种成分的计算值与实测值间差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 一测多评法测定山荷降脂粉中4种成分准确可行，对山荷降脂粉质量控制具有指导意义。

[关键词] 一测多评法;山荷降脂粉;相对校正因子;含量测定

[中图分类号] R283.6;R285          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（c）-0117-05

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of four constituents in Shanhe Jiangzhi Powder by quantitative analysis of multi-components by single marker， and to verify the accuracy and feasibility of the method. Methods The contents of four components in Shanhe Jiangzhi powder were determined by high performance liquid chromatography. The chromatographic column was KromstarTM C18 （4.6 mm x 250 mm， 5 μm）， mobile phase was acetonitrile （A） - 0.4% phosphoric acid aqueous solution （B）， gradient elution， flow rate was 0.8 mL/min， column temperature was 25 ℃， the detection wavelength of sinapine thiocyanate， hyperoside， quercetin and kaempferol were 330， 354， 375， 363 nm， respectively， and the injection volume was 10 μL. With quercetin as the internal standard， the relative positive factors of quercetin and sinapine thiocyanate， Hyperoside and kaempferol were established， and the contents of four components were calculated to achieve multi-evaluation. At the same time， the contents of the four components were determined by external standard method， and the differences between calculated values and measured values were compared to verify the accuracy and feasibility of the method of quantitative analysis of multi-components by single marker. Results The average recoveries of sinapine thiocyanate， hyperoside， quercetin and kaempferol were 1.21%， 1.08%， 0.94% and 1.33%， respectively. The relative positive factors of quercetin and sinapine thiocyanate， hyperoside， kaempferol were 1.23%， 0.53% and 1.41%， respectively. There was no significant difference between the calculated and measured values of the four components in three batches of Shanhe lipid-lowering powder （P > 0.05）. Conclusion It is accurate and feasible to determine the four components in Shanhe Jiangzhi Powder by quantitative analysis of multi-components by single marker， which has guiding significance for the quality control of Shanhe Jiangzhi Powder.

[Key words] Quantitative analysis of multi-components by single marker; Shanhe Jiangzhi Powder; Relative correction factors; Content determination

中药类保健性食品是以中药标准控制的中药为主要原料，依据中医药理论组成配方，并经过安全性和功能性评价的保健食品[1]。自古以来，我国就有“药补不如食补”的经验之谈[2]。山荷降脂粉是山楂、荷叶、莱菔子、昆布等药食两用中药为主要原料，均为实验室采用正交试验设计法，优选出经济、可行的提取工艺，按照一定比例复配自主制备的中药保健食品[3]。现代研究[4-5]发现，生物碱类、黄酮类、挥发油等成分具有降血压、降血脂等多方面的药理活性。山楂[6-7]、荷叶[8]、莱菔子[9]中均含有黄酮类成分，山楂中三萜类[10-11]和甾体类[12]等化学成分及荷叶中的生物碱均具有降血脂功能[13]。同时，莱菔子中含生物碱成分[14]，其水溶性生物碱提高了高密度脂蛋白胆固醇的含量，从而起到降血脂作用[15]。

一测多评法（QAMS）[16-18]是中药主要成分进行定量分析的一种方法，被认为是中药质量控制的有效方法[19]。QAMS法解决了多指标的质量控制模式需要对照品的种类和数量均比较大，且部分对照品价格较贵的问题[20]。目前，生姜、黄连、丹参等中药材的QAMS法已被2015年版《中华人民共和国药典》收载[21]。本研究以槲皮素为内标物，建立槲皮素与芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、山奈酚的QAMS，并进行含量计算，为探索各成分在降血脂中的作用机制奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪配Waters 2998二极管阵列检测器、色谱柱：KromstarTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、AUY 220型电子分析天平（万分之一）、KQ-250 DE型数控超声波清洗器。

1.2 试药

芥子碱硫氰酸盐（批号：151218）、金丝桃苷（批号：160904）、山奈酚（批号：170224）均购自成都克洛玛生物科技有限公司，纯度>98%;槲皮素（批号：wkq 16063005）购自四川省维克奇生物科技有限公司，纯度>98%。其他试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

KromstarTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.4%磷酸（B）溶液，梯度洗脱，流速0.8 mL/min，柱温25℃，芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚检测波长分别为330、354、375、363 nm，进样量10 μL。洗脱梯度：0～25 min，18%A;25～30 min，18%→35%A;30～50 min，35%A。对照品混合溶液及山荷降脂粉供试品溶液色谱图见图1。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密取芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚适量，加甲醇溶液溶解定容，即得各对照品溶液储备液，分别精密量取芥子碱硫氰酸盐储备液1.4 mL（0.32 g/L）、金丝桃苷储备液0.5 mL（0.32 g/L）、槲皮素储备液1.0 mL（0.33 g/L）、山奈酚储备液0.1 mL（0.30 g/L）置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，即得混合对照品溶液，于4℃保存，备用。

2.3 供试品溶液的制备

山荷降脂粉由本实验室经过生产工艺优化后按照一定比例自主制备。精密称取实山荷降脂粉1.0 g，置锥形瓶中，加甲醇-25%盐酸（4∶1）50 mL，超声处理30 min，取滤液用0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.4 标准曲线绘制

分别精密进样“2.2”项下混合对照品溶液2、5、10、15、20 μL，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的回归方程。见表1。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10 μL按照“2.1”色谱条件连续进样6次，测定峰面积。芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚峰面积的RSD分别为0.99%、0.34%、0.32%、0.64%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.3”供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h按照“2.1”色谱条件进样10 μL，测定峰面积，结果芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚峰面积的RSD分别为1.06%、1.05%、0.87%、1.08%，表明山荷降脂粉供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密称取山荷降脂粉1.0023、1.0026、1.0032、1.0030、1.0039、1.0029 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，进样量10 μL，按照“2.1”色谱条件测定芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的平均含量分别为2.9173、0.7982、1.9870、0.1801 mg/g，RSD分别为0.86%、0.95%、1.17%、1.08%，表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的山荷降脂粉共6份，分别置于6个锥形瓶中，分别加入芥子碱硫氰酸盐对照品储备液4.50 mL，金丝桃苷对照品储备液1.25 mL，槲皮素对照品储备液3 mL，山奈酚对照品储备液0.30 mL。按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”色谱条件进行测定，计算加样回收率。结果见表2。

2.9 各成分与内标物间相对校正因子的确定

取“2.2正项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、18、20 μL按照“照 合”色谱条件进样，记录色谱图。以槲皮素为内标物，按公式fsi=fs/fi=As×Ai/Ai×As（其中As为内标物对照品s峰面积;ms为内标物对照品s质量;Ai为某待测成分对照品i面积;mi为某待测成分对照品i质量）计算槲皮素对芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、山奈酚的相对校正因子。结果见表3。

2.10 相对校正因子耐用性考察

2.10.1柱温变化对各成分相对校正因子的影响  取“2.2”项下混合对照品溶液，分别在柱温（25±5）℃条件下分别按“2.1”项下色谱条件进样10 μL分析，计算芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、山奈酚的相对校正因子值分别为1.5174、1.6284、0.8870，其RSD值均小于2%，温度变化对相对校正因子影响不大。

2.10.2 流速变化对各成分相对校正因子的影响  取“2.2” 项下混合对照品溶液，分别在流速（0.8±0.2）mL/min条件下，分别按“2.1”项下色谱条件进样10 μL分析，计算芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、山奈酚的相对校正因子值分别为1.548 9、1.635 9、0.890 2，其RSD值均小于2%，流速变化对相对校正因子影响不大。

2.10.3 色譜柱对各成分相对校正因子的影响  选取实验室Waters C18、Kromasil C18、Phenomenex C18不同色谱柱。取“2.2谱项下混合对照品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进样10 μL分析，计算芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、山奈酚的相对校正因子值，其RSD值均小于2%，表明3种成分的相对校正因子在色谱柱上都有较好的重现性。

2.11 QAMS法与外标法测定结果的比较

精密秤定实验室自制山荷降脂粉3批各1.0 g，按“2.3”制备供试品溶液，按照“2.1”色谱条件进样10 μL，测定峰面积。分别采用外标法和QAMS法计算山荷降脂粉中芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的含量，结果见表4。外标法实测含量值与QAMS计算含量值比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结果表明，QAMS法用于山荷降脂粉中4种成分的质量评价是可靠的。

3 讨论

3.1 供试品制备溶液的优化

3.1.1 提取溶剂的选择  本研究分别考察了不同提取溶剂制备供试品溶液，比较了甲醇、甲醇-25%盐酸（4∶1）、甲醇-50%盐酸（4∶1）三种提取溶剂的提取效果，其中甲醇提取的样品中槲皮素含量较低。上述提取方法得到的大部分是黄酮苷类化合物。槲皮素糖苷是槲皮素和糖通过缩合反应形成的糖苷化合物，其中的糖苷键在碱性条件下稳定，酸性条件下易发生水解，故甲醇提取的样品中槲皮素含量较低[22]。黄酮苷类化合物在酸性提取条件下水解，甲醇-25%盐酸（4∶1）条件下提取，黄酮类成分的提取率均有所升高。为进一步提高黄酮类成分含量，可通过增加酸的浓度来实现。甲醇-50%盐酸（4∶1）条件下进行提取，其黄酮类成分含量虽有提高，但芥子碱硫氰酸盐含量降低。综合考虑，选用甲醇-25%盐酸（4∶1）为提取溶剂。此条件下，目标成分的含量较高且干扰杂质峰较少。

3.1.2 提取方法的选择  本研究比较超声提取和加热回流两种提取方法。结果显示，两种提取方式所得到的各成分含量都比较接近，但考虑到超声法简单、易操作，故选取超声法作为供试品溶液制备的提取方法。

3.2 流动相溶剂的选择

本研究考察了乙腈-0.4%甲酸、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.4%磷酸-1%三乙胺溶液流动相的对待测物质分离效果的影响。结果表明，乙腈-0.4%甲酸、乙腈-0.4%磷酸流动相酸对待测物质分离度、出峰时间等基本无影响，均可实现待测物质的有效分离，但乙腈-0.4%磷酸条件下，理论塔板数稍高。因待测物质芥子碱硫氰酸盐多在碱性条件下分离，考察了乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.4%磷酸-1%三乙胺溶液对实验结果的影响，乙腈-0.4%磷酸-1%三乙胺溶液条件下，芥子碱硫氰酸盐分离度较好，峰形得到改善，但是其黄酮类成分峰形变差，说明碱性条件下，不适于黄酮类成分的分离。综合以上考虑选择乙腈-0.4%磷酸溶液为流动相，且柱后处理简便。

综上所述，本研究采用二极管阵列检测器进行全波长扫描，芥子碱硫氰酸盐、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚最佳检测波长分别为330、354、375、363 nm。槲皮素在330～375 nm均有紫外吸收，且考虑到槲皮素对照品价廉易得、性质稳定，故选择槲皮素作为内标物进行色谱峰定位，实现对其他成分的同时测定。本研究将QAMS法用于山荷降脂粉中4个成分的含量测定，与外标法实际所测值接近，无明显差异，说明QAMS法可用于药材多指标成分的测定，这对控制山荷降脂粉质量具有指导意义。

[参考文献]

[1]  王林元，张建军，王淳，等.对中药类保健食品的认识及研究开发策略[J].中国中药杂志，2016，41（21）：3927-2929.

[2]  游露怡.海宁市中药保健品营销策略的研究[J].商场现代化，2017（21）：75-76.

[3]  余婷婷，张显，郏文青，等.山楂荷叶复合固体饮料的制备工艺优化及功能性成分含量测定[J/OL].食品工业科技：1-9[2018-08-27]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20180427.1559.062.html.

[4]  王福刚，曹娟，刘斌，等.荷叶的化学成分及其药理作用研究进展[J].时珍国医国药，2010，20（9）：2339.

[5]  刘贝涛.荷叶的化学成分和药理作用探究[J].生物制药与研究，2016（7）：134-135.

[6]  赵文婷，刘溪，朱竟赫，等.山楂总黄酮对心肌缺血大鼠尿液代谢谱的影响[J/OL].天然产物研究与开发：1-10[2018-08-27]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/51.1335.Q.20180725.1320.002.html.

[7]  王永，粱宇明.三七、丹参、山楂粉结合阿托伐他汀治疗高脂血症临床疗效研究[J].中国医药科学，2018，8（10）：39-41，88.

[8]  夏明辉，赵晶，韩立峰，等.荷叶化学及药理学研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2015，17（11）：102-104.

[9]  赵振华，李媛，季冬青，等.莱菔子化学成分与药理作用研究进展[J].食品与药品，2017，19（2）：147-150.

[10]  王丹，杨柳青，郑胜，等.三峡库区野山楂对高脂血症人群的降脂疗效研究[J].现代预防医学，2012，39（19）：4956-4957.

[11]  杨柳青.三峡库区野山楂与山楂调节血脂作用的比较研究[D].长沙：湖南中医药大学，2011：10-11.

[12]  楼陆军，罗洁霞.高云.山楂的化学成分和药理作用研究概述[J].中國药业，2014，23（3）：92-94.

[13]  邢峰丽，封小强，刘伟花.荷叶的药理作用研究概述[J].环球中医药，2016，9（1）：115-118.

[14]  李民，周洪雷，丁臻，等.大孔吸附树脂分离纯化莱菔子水溶性生物碱的工艺研究[J].辽宁中医杂志，2013，40（5）：974-976.

[15]  张国侠，盖国忠.莱菔子总生物碱对Apo E基因敲除小鼠血脂的影响[J].中国老年学杂志，2010，30（6）：844-845.

[16]  黄琪，贾鹏晖，吴德玲，等.一测多评法结合UPLC-ELSD技术同时测定知母中7个成分的含量[J].中华中医药杂志，2018，33（7）：3143-3146.

[17]  翟宏宇，单柏宇，王海洋，等.一测多评法测定保心宁片中6个丹参类指标性成分的含量[J].药物分析杂志，2018， 38（6）：973-978.

[18]  昝珂，崔淦，过立农，等.一测多评法同时测定冬虫夏草中5个核苷类成分的含量[J].药物分析杂志，2018，38（4）：630-635

[19]  蒋向辉，蒋天智，苑静，等.一测多评法测定青钱柳中5种黄酮类成分含量[J].华中师范大学学报，2017，51（5）：620-624.

[20]  何冰，刘艳，杨世艳，等.HPLC一测多评法同时测定双青咽喉片中10种成分[J].中草药，2013，44（8）：974-981.

[21]  陈香伶，杜洪志，何席呈，等.一测多评法测定贵州产切面红色土茯苓中3种活性成分的含量[J].中国实验方剂学杂志，2018，24（15）：93-99.

[22]  惠秋莎.槲皮素及其糖苷的提取和含量测定方法概述[J].药学服务与研究，2011，11（4）：294-297.

（收稿日期：2018-06-01  本文编辑：王   蕾）