PNPLA3基因多态性与酒精性肝病发生的关系

陈攀丽 唐建荣 付雪芹

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)发病率可达283～493万人左右[1]，临床上ALD的发生能够导致患者多器官功能衰竭的发生，增加患者的死亡风险[2]。PNPLA3基因位点rs738409多态性的改变能够通过对于局部肝脏上皮细胞微环境的改变，诱导趋化因子和补体成分的激活，进而导致肝脏小叶结构的损伤。PNPLA3基因位点多态性还能够通过增加肝脏上皮细胞对于酒精的代谢障碍，导致酒精的蓄积效应明显增强，加剧了酒精对于肝脏上皮细胞的损伤[3]。部分研究者探讨了PNPLA3基因多态性与消化系统恶性肿瘤的关系，认为PNPLA3基因多态性能够导致肿瘤易感性的明显上升，同时还能够降低肿瘤放化疗治疗的敏感性[4-5]，但关于PNPLA3基因多态性与ALD的关系研究不足。本研究选取2016年1月至2018年2月在我院治疗的ALD患者140例，探讨了PNPLA3基因位点rs738409多态性与ALD的关系，报道如下。

资料和方法

一、一般资料

选取2016年1月至2018年2月在我院治疗的ALD患者140例(ALD组)，同时选取嗜酒者但未诊断ALD志愿者100例(嗜酒组)和不饮酒健康志愿者100例(对照组)作为对照。纳入标准：(1)诊断符合《酒精性肝病诊疗指南》中的标准；(2)嗜酒组符合：有强烈的饮酒渴求、发作时间固定，不饮酒时出现生理和心理症状，同时B超、肝功能等检查无异常；(3)患者及家属对本研究知情同意。排除标准：(1)合并有病毒性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病等；(2)合并有恶性肿瘤，心、肺等重要脏器功能不全等。

二、实验方法

PNPLA3基因多态性的检测：取冻存的血清保存液体，按照10 000 r/min的离心速度进行分离，每1 mL TRIzol试剂裂解的样品中加入0.2 mL氯仿，进行裂解操作，4 ℃冰上采用无酶的RNA冲洗液进行洗涤，再次10 000 r/min离心5 min，得到RNA。加逆转录酶后， 37 ℃孵育60 min生成cDNA。进行PCR产物扩增 ，反应设置为：93 ℃ 2 min、93 ℃ 1 min、55 ℃ 2 min，共40个RT-PCR循环。

采用罗氏检测公司生产的multipical多态性检测试剂盒，在相应的位点进行单碱基的序列检测。使用ABI1310进行PCR跑胶电泳，仪器购自美国Life Technologies公司，采用GENEMAPPER软件进行对比分析，仪器购自美国Life Technologies公司。

采集入院后静脉血，离心后收集上清液，采用免疫发光法检测血清中PCⅢ和ⅣC水平，检测仪器为美国Bio-Bad全自动酶标仪，检测试剂盒购自南京凯基生物制剂有限公司；采用全自动生化法检测AST、ALT和GGT值，配套试剂购自南京凯基生物制剂有限公司。

三、统计学处理

统计分析采用SPSS19.0软件，计量资料采用(均数±标准差)表示，3组间比较使用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料比较使用卡方检验；采用Hardy-Weinberg平衡定律检验样本群体代表性。检验水准α=0.05。

结 果

一、 各组受试者一般特征比较

对照组、嗜酒组和ALD组性别、年龄等一般特征比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组一般特征比较

二、 基因多态性检测

PNPLA3基因位点rs738409存在C/G突变，得到3种基因型，分别为CC型、GC型、GG型，见图1。

图1 PNPLA3基因酶切电泳图

1：GG型；2：CG型；3，4,5,7,8，9：CC型；M：Marker

三、 各组PNPLA3基因型及等位基因比较

对照组、嗜酒组和ALD组PNPLA3基因多态型符合Hardy-Weinberg平衡定律；ALD组基因型GG型和等位基因G的比例为18.57%和39.29%，明显高于对照组和嗜酒组(χ2=6.586和4.290，10.714和8.504，P<0.05)。见表2。

四、 ALD组不同基因型患者AST、ALT等比较

GG型患者PCⅢ和ⅣC水平明显高于CC型和CG型(P<0.05)。见表3。

讨 论

ALD的发生率有逐渐上升的趋势，特别是在有自身免疫力紊乱的人群中，ALD发生风险更高，肝功能衰竭的风险更大[6]。ALD的发生不仅能够导致肝脏上皮细胞代谢和内分泌功能障碍，同时还能够增加远期恶性消化道病变的发生风险，增加肝癌和胆囊癌等的发生几率[7-8]。

PNPLA3基因rs738409位点的改变能够诱导单核细胞过度激活，提高了中性粒细胞对于肝脏上皮组织的损伤程度。rs738409位点的改变能够通过影响PNPLA3的转录和翻译，导致下游炎症因子的激活，增加了肿瘤坏死因子α对于肝脏小叶结构或者小叶导管的破坏作用。基础研究还认为，PNPLA3基因rs738409位点的改变能够加剧T淋巴细胞的自身免疫性损伤，降低肝脏上皮细胞对于高负荷酒精的耐受程度，导致肝脏上皮细胞的变性程度明显增加[9]。

由于体质指数、饮酒量等因素可能在一定程度上影响基因多态性的结果，本研究对于不同组别患者的一般临床资料分析表明，不同组在体质指数、年龄、饮酒量等方面并无明显的差异，排除了相关因素对于统计学结果的影响，体现了本研究的科学性。等位基因的分析显示，主要以CC型、GC型、GG型为主，其中ALD组基因型GG型和等位基因G明显高于对照组和嗜酒组，差异较明显，提示了基因型GG型和等位基因G对于ALD的发生可能具有显著的促进作用。这主要与以下几个方面的病理作用有关：(1)基因型GG型和等位基因G的上升能够导致PNPLA3转录活性的增强，诱导肝脏上皮细胞膜修复能力下降，在持续性较高乙醇浓度的损伤下，肝脏上皮细胞的持续性凋亡更显著；(2)基因型GG或者等位基因G的上升能够导致肝脏上皮细胞线粒体功能的不足，影响到上皮细胞的能量利用，导致其对于乙醇的代谢和分解能力明显下降。 王健等[10]研究者也探讨了基因多态性与肝病的关系，发现在肝病小鼠模型中，PNPLA3基因多态性的比例可平均上升30%以上。PCⅢ和ⅣC是评估肝脏纤维化的指标，本研究中GG型患者PCⅢ和ⅣC水平明显高于CC型和CG型，提示GG基因型的ALD患者肝脏纤维化改变更明显。这主要由于基因型GG型能够导致肝脏上皮间质中成纤维细胞的成熟，并诱导氧化应激反应的发生，促进肝脏病变的持续性进展。 AST、ALT和GGT是评估患者肝功能的指标，本研究中并未发现GG基因型与AST、ALT和GGT的关系，提示基因多态性并不能显著影响肝功能水平。

表2 各组PNPLA3基因型及等位基因比较

表3 ALD组不同基因型患者AST、ALT等比较

注：a与CC型比较P<0.05；b与CG型比较P<0.05