黄酒麦曲中一株产细菌素菌株的鉴定及其降生物胺功效研究

邢 旋，任 清

(北京工商大学 食品学院， 北京 100048)

黄酒是以糯米和黍米等谷物为原料发酵酿制而成的低酒精饮料，是我国特有的具有悠久历史文化的酒种[1]。传统的黄酒采用边糖化边发酵的生产工艺，开放式的半固态发酵条件导致黄酒发酵醪的微生物菌群结构异常复杂，极易产生生物胺[2-3]。黄酒中的生物胺主要是由微生物分泌的氨基酸脱羧酶催化游离氨基酸脱羧生成的一类物质，比如组胺、精胺、腐胺和尸胺等，少量生物胺为生物体内的正常活性成分，但若人体过量摄入外源生物胺，会发生中毒反应，引起头痛心悸呼吸紊乱，对神经心血管系统造成损伤，严重时还会危及生命[4-7]。因此，降低生物胺含量已经成为黄酒生产中质量控制的重要目标。

目前，黄酒生产通常采用改进生产工艺来控制生物胺，例如采用乳酸菌的生物酸化浸米技术、调整贮藏温度和控制游离氨基酸含量等技术[8-10]。这些技术虽然一定程度上降低了生物胺含量，但是，仍然不能满足黄酒质量安全的需求。近年来，随着黄酒微生物研究的深入，筛选利用不产生物胺菌株，特别是高产细菌素的菌株酿造黄酒，将会是黄酒生产中控制生物胺含量的有效途径。

细菌素是由某些细菌产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或肽类物质[11]，因其易被人体胃肠道中的蛋白酶降解，具有安全、无毒、抗菌等特点，因此，细菌素被认为最有前途的食品防腐剂[12-13]。黄酒发酵过程中，运用产细菌素的菌株，抑制产生物胺菌的生长，可能是降低黄酒中生物胺含量的有效途径。本实验从黄酒酒曲中发现一株产细菌素菌株，筛选鉴定并对其降生物胺功效研究，以期为降低黄酒中生物胺含量提供理论依据和有价值的微生物。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1实验材料与培养基

黄酒麦曲，北宗黄酒有限公司提供；菌株M28，由实验室自制黄酒麦曲中分离；腐生葡萄球菌，阪崎肠杆菌，乳酪短杆菌，芽孢杆菌，阴沟肠杆菌，均为实验室黄酒发酵过程中分离出来的杂菌；通用引物(27f和1492r)，生工生物工程(上海)股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、2xPfu PCR MasterMix，天根生化试剂公司。

TPY琼脂培养基的制备：水解酪蛋白10.0 g、大豆胨5.0 g、酵母粉2.0 g、葡萄糖5.0 g、L-半胱氨酸0.5 g、K2HPO42.0 g、MgCl20.5 g、ZnSO40.25 g、CaCl20.15 g、FeCl31×10-6g、琼脂20.0 g。pH值(6.5±0.1)，25 ℃，加蒸馏水定容至1 L，加热煮沸溶解，121 ℃高压灭菌20 min。

MRS培养基的制备：蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、CH3COONa 5.0 g、MgSO40.2 g、MnSO40.05 g、琼脂粉15.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、K2HPO42.0 g、柠檬酸三胺2.0 g、Tween 80 1 mL，加蒸馏水定容至1 L，加热煮沸溶解，121 ℃高压灭菌20 min。其液体培养基配制时不加琼脂粉。

液体脱羧酶检测显色培养基的制备：胰蛋白胨5 g、酵母膏5 g、牛肉膏5 g、 NaCl 2.5 g、葡萄糖0.5 g、Tween 80 1 mL、 MgSO40.2 g、 MnSO40.05 g、FeSO40.04 g、柠檬酸铵2 g、 K2HPO42 g 、CaCO30.1 g、磷酸吡多醛0.05 g、溴甲酚紫0.06 g、放线菌酮0.05 g。分别添加赖氨酸5.0 g、鸟氨酸盐酸盐5.0 g、L-组氨酸盐酸盐2.0 g、酪氨酸1.0 g、苯丙氨酸2.0 g，配成5种培养基，用于检测尸胺、腐胺、组胺、酪胺、苯乙胺。调pH值至5.3，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

固体脱羧酶检测显色培养基的制备(g/L)：琼脂粉18.0，其他成分同液体脱羧酶培养基，pH值为5.3，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

LB培养基的制备：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、琼脂粉15 g，加蒸馏水至1 000 mL, 用5 mol/L NaOH(约0.2 mL)调pH=7.2，121 ℃灭菌30 min。

1.1.2主要实验设备

XP型基因扩增仪，杭州博日科技有限公司；Imager 2200型凝胶成像系统，美国Alpha公司。

1.2 实验方法

1.2.1菌株M28产细菌素特性验证分析

1.2.1.1 牛津杯抑菌实验

采用牛津杯法分析菌株M28抑菌效果，指示菌株为腐生葡萄球菌、短酪乳杆菌、地衣芽孢杆菌、短小杆菌、解淀粉芽孢杆菌、可可链霉菌、枯草芽孢杆菌、木糖氧化无糖杆菌、欧文氏杆菌、沙福芽孢杆菌、芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、阴沟肠杆菌，指示菌株均由黄酒麦曲筛选鉴定所得。

在灭菌的培养皿中注入约25 mL LB培养基，均匀铺满培养皿底部，待LB培养基凝固后，取100 μL指示菌菌悬液加入LB固体培养基中，均匀涂布于平板上，在表面等间距放置灭菌的牛津杯。接着将100 μL M28发酵液注入到小孔内，4 ℃下扩散3～5 h，然后将培养皿置于37 ℃培养24～36 h，用尺子测定抑菌圈的直径。

将M28菌株接种于装有10 mL MRS液体培养基37 ℃下培养24 h，发酵液经1×104r/min离心10 min取得上清液，牛津杯法测定发酵上清液的抑菌活性。

1.2.1.2 排除有机酸的干扰实验

发酵上清液对指示菌的抑制作用可能是细菌素也可能是酸性物质如乳酸等有机酸作用的结果, 为排除酸的干扰,将1.2×104r/min离心10 min的上清液用2.5 mol/L的NaOH溶液中和至pH值为6.5～7.0，通过牛津杯双层平板法进行抑菌试验，向牛津杯中加入中和前后的发酵上清液100 mL，并在水平条件下将平板放于4 ℃冰箱中扩散5 h,置于37 ℃下培养24 h，分别检测两者的抑菌活性，比较中和酸前后抑菌圈的差异，每次实验3次重复。

1.2.1.3 过氧化氢作用的检测与排除

将过氧化氢酶溶解于50 mml/L的磷酸缓冲液(pH=7.0)中配成母液，加入到经酸排除的实验菌株上清液中，使过氧化氢酶的最终浓度达到5 mg/mL，37 ℃水浴2 h后取出，检测过氧化氢酶处理后上清液的抑菌活性，取3次平行实验求均值。

1.2.1.4 蛋白酶敏感实验

将蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶分别溶解在50 mmol/L的磷酸缓冲液(pH=7.6)中配成母液，加实验菌株到发酵上清液中，使其终浓度为1 mg/mL，调节pH值至各酶的最适作用范围，37 ℃水浴2 h后取出。再将pH值调回至6.5～7.0，并用缓冲液稀释相同倍数的发酵上清液作为对照，检测各种蛋白酶对发酵上清液抑菌活性的影响。

1.2.2菌株M28生物学鉴定

1.2.2.1 形态学特征观察

挑取菌株划线接种于相应的固体MRS培养基上，37 ℃培养48 h，观察并记录其菌落形态特征，挑取单菌落进行涂片，革兰氏染色，于显微镜下观察并记录其大小、颜色、形状排列等。

1.2.2.2 菌种的16S rDNA的鉴定

挑取平板上的菌落，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA作为PCR的模板。采用通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增细菌的16S rDNA序列。反应体系(25 μL)为12.5 μL 2xPfu PCR MasterMix、7.5 μL dd H2O、23 μL DNA模板、1 μL 27f (1 0 μmol / L )、 1 μL 1492r(10 μmol/L)。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；然后72 ℃延伸5 min，4 ℃暂时保存，-20 ℃条件下保存备用。取5 μL的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳检测后的PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成纯化和测序，获得16S rDNA基因序列。测序结果在NCBI的Genebank 中进行 BLAST 分析比对，进行同源序列搜索，根据搜索结果，确定菌株的种属。

1.2.3脱羧酶培养基显色反应

取活化后的M28菌液0.2 mL于固体脱羧酶培养基上进行涂布，37 ℃恒温培养箱中培养4 d，观察颜色变化，黄色为阴性，红色或紫色为阳性。

1.2.4生物胺含量的高效液相色谱检测

将黍米淘洗干净并浸泡24 h，加入2.5倍质量的去离子水煮熟，加入ω=0.1%糖化酶糖化60 min，随后加入φ=15%的黄酒麦曲，同时加入φ=0.1%经活化的M28菌液(10 mol/L)拌匀，装入黄酒发酵罐中28 ℃下发酵10 d，然后于20～25 ℃后酵室发酵50 d，然后经榨酒和煎酒至成品黄酒。以不添加M28菌液酿制的黄酒为对照。采用GB 5009.208—2016《食品中生物胺的测定》检测其生物胺含量[14]。

1.2.5黄酒中挥发性物质的GC-MS分析

黄酒发酵同1.2.4节，GC- MS技术分析检测黄酒中挥发性物质。

样品处理：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取头对黄酒样品中的挥发性成分进行萃取。在15 mL的顶空瓶中加入8 mL黄酒样品，2.5 g NaCl，插入萃取头，于50 ℃吸附萃取45 min，230 ℃条件下解吸附5 min，用于GC- MS的数据采集分析。

气相色谱条件：进样温度230 ℃，载气He，分流进样，分流比50∶1，流速1 mL/min。色谱柱型号为DB- WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，初始柱温为35 ℃，保持4 min，以5 ℃/min的速率升温，最终温度为150 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 的速度升温至210 ℃。

质谱条件：EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，扫描范围30.00～350.00 u。

定量方法：以2-辛醇为内标的半定量法。

1.2.6氨基酸态氮、酒精度和pH值分析检测

采用GB/T 13662—2018《黄酒》分析检测黄酒氨基酸态氮、酒精度和pH值[15]。

2 结果与分析

2.1 菌株M28产细菌素特性验证分析

菌株M28由实验室自制黄酒麦曲中分离，腐生葡萄球菌，阪崎肠杆菌，乳酪短杆菌，芽孢杆菌，阴沟肠杆菌，均为实验室黄酒发酵过程中分离出来的杂菌，也是北方黄酒发酵常见的污染菌。

采用牛津杯法分析菌株M28抑菌效果见图1、图2和表1，菌株M28对分离出来的13种杂菌的5种具有明显的抑制作用，其无菌发酵液也具有相同的抑菌特性，说明菌株M28能够产生抑菌物质，对腐生葡萄球菌、阪崎肠杆菌、乳酪短杆菌、芽孢杆菌和阴沟肠杆菌均具有抑制效果。

N28、M29、N18、J22和J18均为实验室分离出来尚未鉴定的菌株，没有抑菌特性图1 菌株M28抑菌实验Fig.1 Antibacterial experiment of strain M28

图2 M28发酵上清液抑菌活性Fig.2 Antimicrobial activity of strain M28 fermentation supernatant

排除有机酸和过氧化氢实验结果表明，抑菌特性可能是因为M28产生了抑菌物质，经蛋白酶K和胰蛋白酶降解后，失去了抑菌活性，说明该物质为蛋白质或多肽，为细菌素类物质，该细菌素具有较广谱的抑菌活性，而且对蛋白酶K和胰蛋白酶敏感，但是，对胃蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶的酶敏感性较弱。

2.2 菌株M28生物学鉴定

M28菌落形态为圆形，表面光滑，凸起，不透明，浅黄色，边缘整齐，光学显微镜下观察，革兰氏染色阳性，球状或短棒状，无芽孢(见图3)。对M28菌株进行16S rDNA分析(见图4)，将PCR扩增产物送交测序公司进行测序，返回序列进行比对分析，通过进化树分析(见图5)，证明M28为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

表1 M28细菌素鉴定实验

“+”表示反应阳性，“-”表示反应阴性。

视图为10×100倍。图3 M28菌体形态图Fig.3 Characteristic of M28 cells

图4 M28菌株16S rDNA的电泳检测图Fig.4 Electrophoretic detection of 16S rDNA of strain M28

图5 基于16S rDNA序列构建的进化树Fig.5 Phylogenetic trees based on 16S rDNA sequences

2.3 菌株M28对黄酒生物胺的影响

脱羧酶培养基显色反应实验中，培养初期，细菌繁殖，利用葡萄糖产酸使培养液pH值下降，溴甲酚紫指示剂变黄色，继续培养，若细菌产氨基酸脱羧酶，则氨基酸在脱羧酶的作用下发生脱羧反应生成胺和二氧化碳，pH值上升呈碱性，使含指示剂的培养基由黄色变为紫色，由此，可通过培养基颜色变化判断细菌是否产生物胺。

脱羧酶培养基显色反应结果如表2所示，培养腐生葡萄球菌和阪崎肠杆菌，能够产腐胺、酪胺、尸胺、组胺和苯乙胺5种常见的生物胺；乳酪短杆菌产腐胺、酪胺、尸胺和组胺4种生物胺；芽孢杆菌产酪胺、尸胺、组胺和苯乙胺4种生物胺；阴沟肠杆菌产腐胺、酪胺、尸胺和苯乙胺4种生物胺。但是，菌株M28培养过程中没有检测到生物胺的产生，说明菌株M28自身不产生物胺。

表2 生物胺显色反应实验

“+”表示反应阳性，“-”表示反应阴性。

黄酒发酵过程中添加强化M28菌株，应用HPLC检测黄酒中的生物胺含量，实验结果如图6。添加强化M28菌株酿造的黄酒与对照未添加的相比，生物胺含量明显降低，其中，添加M28菌株酿造的黄酒未检出酪胺和尸胺，腐胺、组胺和苯乙胺含量显著降低，腐胺含量降低最显著达52%，表明添加强化M28菌株可以显著降低黄酒中的生物胺的含量，提高黄酒品质，可能是因为M28菌株可以产生细菌素，有效抑制了一些产生物胺杂菌的生长繁殖，而M28菌株本生不产生物胺，因此，黄酒发酵过程中添加强化M28菌株，可以显著降低黄酒中的生物胺含量。

图6 2种黄酒中生物胺的含量Fig.6 Biogenic amines contents in two kinds of Huangjiu

2.4 菌株M28对黄酒风味品质的影响

黄酒发酵过程中添加强化M28菌株，应用GC- MS检测黄酒中的挥发性物质，实验结果见表3和表4。添加强化M28菌株酿造的黄酒中检测出烷烃类、醇类、酯类、酮类、醛类、酸类、吡嗪类、酚类和其他挥发性物质共107种，未添加M28菌株酿造的黄酒中，共检测出挥发性物质105种，而且挥发性风味物质的含量也没有显著差异。表明黄酒发酵过程中，添加强化M28菌株对黄酒的香味品质基本没有影响。

黄酒发酵过程中添加强化M28菌株，分析检测黄酒中的氨基酸态氮、酒精度和pH值，实验结果见表5。添加强化M28菌株酿造的黄酒与对照黄酒相比，酒精度没有明显变化，氨基酸态氮含量显著提高，pH值显著降低。分析原因，可能因为添加M28菌株，有效抑制了一些产生物胺杂菌的生长繁殖，氨基酸转化合成生物胺减少，氨基酸积累增多，因此，氨基酸态氮含量提高，酸度降低。

表3 2种黄酒中挥发性物质的种类

表4 2种黄酒中挥发性物质的含量

表5 2种黄酒中氨基酸态氮、酒精度和pH值

3 讨论与结论

菌株M28由实验室自制黄酒麦曲中分离，腐生葡萄球菌、阪崎肠杆菌、乳酪短杆菌、芽孢杆菌和阴沟肠杆菌，均为实验室黄酒发酵过程中分离出来的杂菌，也是制曲过程中或者发酵过程中常见的污染杂菌。M28经鉴定为戊糖片球菌，该片球菌能够产生细菌素，对黄酒中产生物胺的腐生葡萄球菌、阪崎肠杆菌、乳酪短杆菌、芽孢杆菌和阴沟肠杆菌均具有抑制作用。

菌株M28自身发酵不产生物胺，黄酒发酵过程中，添加强化M28菌株，黄酒的品质发生了变化，一方面，添加强化M28菌株，香味物质和酒精度没有明显变化，但是，生物胺含量显著降低，氨基酸态氮含量显著提高，提高和改善了黄酒品质；另一方面，添加强化M28菌株，pH值降低，即酸度提高了，可能会影响原来的口感。如果结合生产工艺的改进和延长窖藏时间，可能会降低酸度。总之，M28作为一株可以降低黄酒中的生物胺含量的功能性菌株，随着研究的深入，将会在黄酒酿造和品质改良中发挥重要的作用。