烟曲霉脂肪酶B在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

唐 薇，黄伟谦，杨 博,*，王永华，蓝东明

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院， 广东 广州 510641；2.华南理工大学 生物科学与工程学院， 广东 广州 510006)

脂肪酶(EC 3.1.1.3) 是一类广泛存于动物、植物及微生物中，可以催化酯类水解、合成和酯交换的α/β折叠水解酶。脂肪酶被广泛应用于近代的新材料、食品加工、医药、化学合成、生物能源等行业，是重要的工业生物催化剂之一[1-2]。1990年，对米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucormieheilipase, RML)相关研究的首次报道[3]，掀起了一轮脂肪酶研究热潮，使得人们对脂肪酶分子的空间结构和催化机理都有了进一步了解。来源不同种属的、具有不同特性的脂肪酶，不仅仅对工业化生产有重大的应用前景，而且对推动相关科学研究也具有十分深远的意义。

南极假丝酵母脂肪酶B(Candidaantarcticalipase B, CALB)是一种具有宽泛的底物特异性、高对映选择性，以及在水和非水环境中均具有强稳定性的生物催化剂，是工业生产和科学研究中使用最为广泛的脂肪酶[4-5]。Sonseca等[6]利用CALB，高效合成了新型的生物降解塑料——聚丁二酸丁二酯- 丁二酸双亚麻油酸二醇酯(poly(butylene succinate-co-dilinoleic succinate))；Alalla等[7]利用CALB动力学，拆分了一种重要的药物化学中间体β-氨基醇；而当前已报道的CALB家族脂肪酶屈指可数[8]，大多数CALB家族类脂肪酶研究只停留在基因预测阶段，并没有被表达和表征。挖掘新型CALB家族脂肪酶并深入研究其特性，可进一步满足不同工业应用的需求；同时可拓宽对CALB家族脂肪酶的认识，为进一步应用蛋白质工程改造CALB家族脂肪酶提供理论基础。

当前已报道的CALB家族脂肪酶除了CALB，还包括来源于阿氏丝孢酵母MSR54(TrichosporonasahiiMSR54)[9]、玉米黑粉病菌521(Ustilagomaydis521)[10]、皱波褶尾菌(Plicaturopsiscrispa)[8]、湖北假酵母SY62(PseudozymahubeiensisSY62)[11]、丝黑穗病菌SRZ2(SporisoriumreilianumSRZ2)和橡胶假酵母GHG001(PseudozymabrasiliensisGHG001)[12]的脂肪酶，并且仅有前3个酶的酶学性质被表征及深入研究。本研究克隆了来源于烟曲霉(AspergillusfumigatusGIM3.20)的GALB家族的脂肪酶B(AFLB)基因，并在毕赤酵母中表达，分析了AFLB的序列特征；研究了重组脂肪酶AFLB的酶学特性，以期为AFLB的工业应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

大肠杆菌E.coliDH5α菌株、毕赤酵母GS115及表达载体pPIC9K-His均为本实验室保存；AspergillusfumigatusGIM3.20，购自广东省微生物菌种保藏中心；反转录cDNA第一链合成试剂盒、RNAiso Plus试剂盒、PrimeSTAR Max、限制性内切酶(EcoRI、NotI、SalI)和T4 DNA lingase，均购自宝生生物科技有限公司；Ni Sephraose 6 Fast Flow 和 Desalting脱盐柱，购自 GE Healthcare Life Sciences(UK)；基因引物、DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，购自上海生工生物科技有限公司。其他试剂皆为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1脂肪酶AFLB基因分析

利用Vector NTI 10 软件(美国Invitrogen 公司)，对AFLB的cDNA序列进行翻译并获得对应的氨基酸序列。利用ExPASy (https://www.expasy.org/)线上软件分析等电点和蛋白质分子量，并利用Blast P ( http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ) 分析序列相似性。

1.2.2脂肪酶AFLB基因的克隆与载体构建

脂肪酶AFLB成熟肽利用软件 Primer Premier 5 设计引物如下：上游引物为5′-TCAGAATTCGCAGTCATTCCCCGCGGC′(下划线部分为EcoR I 酶切位点)，下游引物为 5′- ATTGCGGCCGCTATGAGCGTAGCTCGCAATGG′ (下划线部分为Not I酶切位点)。参照文献 [13]的方法，提取A.fumigatusGIM3.20的总RNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，PCR 扩增脂肪酶AFLB基因片段。PCR具体过程：98 ℃预变性3 min，98 ℃变性5 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸80 s，进行32个循环，于4 ℃下保存。将PCR 产物电泳检测并割胶回收。PCR产物与质粒pPIC9K-His经EcoR I和Not I双酶切并进行产物纯化回收，使用T4 DNA lingase 将目的基因片段与表达载体片段进行连接，连接产物转化至E.coli DH5α细胞。将重组菌涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板，37 ℃恒温箱放置12 h，挑选阳性菌株并测序鉴定。

1.2.3脂肪酶 AFLB表达和纯化

使用SalI内切酶将测序验证无误后的质粒pPIC9K-AFLB-His线性化并进行产物纯化回收。将线性化质粒产物电转化GS115感受态细胞，涂布到葡萄糖基础培养基(MD)平板，30 ℃恒温箱培养3 d。挑取单菌落接种于5 mL YPD液体培养基中，30 ℃、200 r/min培养20 h后转接至100 mL BMGY液体培养基中，30 ℃、200 r/min下培养24 h。在超净台中静置30 min，去掉上清液，加入200 mL无菌BMMY液体培养基重悬菌体，28 ℃、200 r/min下培养，每隔24 h加入2 mL甲醇，总共诱导96 h。将发酵后的菌体液在4 ℃，10 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液并用0.45 μm的滤膜进行过滤，滤过液转至膜包进行浓缩，浓缩至原体积的1/10。将上清浓缩液加到50 mmol/L、pH值7.4的磷酸缓冲溶液预先平衡的镍柱(Ni Sephraose 6 Fast Flow)中，用25 mmol/L咪唑缓冲溶液梯度冲洗杂蛋白，用125 mmol/L的咪唑缓冲溶液冲洗目的蛋白。接着用Desalting 脱盐柱对目的蛋白洗脱液进行脱盐处理，最终纯化后的脂肪酶AFLB溶解在50 mmol/L、pH值为7.0的磷酸缓冲溶液中。使用SDS-PAGE凝胶电泳对纯化样品进行检测。

1.2.4脂肪酶 AFLB的活性测定与酶学性质表征

1)脂肪酶活性的测定。采用滴定法测定脂肪酶活性[14]。在1 min内，水解三丁酸甘油酯乳化液底物，释放1 μmol脂肪酶酸所需的酶量定义为一个酶活单位。

2)脂肪酶AFLB最适反应pH值的测定。在50 mmol/L不同pH值的缓冲体系中，包括甘氨酸- 盐酸(pH值 3.0)、柠檬酸钠/柠檬酸( pH 值4.0～5.0)、Na2HPO4/NaH2PO4( pH 值6.0～7.5)、Tris-HCl ( pH值 8.0～9.0)，在40 ℃，测定不同pH值缓冲液中脂肪酶AFLB的水解活力。以相应pH值下的酶活力为100%，其余的以相对酶活力表示。

3)脂肪酶 AFLB 最适反应温度及热稳定性的测定。将反应混合液分别置于 pH 值7.0、50 mmol /L磷酸缓冲溶液( 10～70 ℃) 中，孵育10 min，加入等量的脂肪酶AFLB，分别在不同温度下反应15 min，测定不同温度下脂肪酶的活力。同样，以相应温度下的酶活力为100%，其余的以相对酶活力表示。分别将适量的脂肪酶AFLB纯酶液置于不同温度(30、50、60、70 ℃) 的水浴锅进行水浴，每隔一定时间分别取样并测定该酶液的残余酶活力。以热处理前的酶活力为100%，其余的以相对酶活力表示。

4)脂肪酶 AFLB 钠盐耐受性的测定。分别将一定量的脂肪酶AFLB纯酶液与不同质量的NaCl混合，制得含有不同质量浓度(0～6 mol /L)NaCl 的AFLB酶溶液， 30 ℃静置2 h后测定各酶液样品的残余酶活力。以无加入NaCl的酶活力为100%，其余的以相对酶活力表示。

5)脂肪酶AFLB底物特异性的测定。使用比色法[15]，分别将不同长度酰基的对硝基苯酯(C2～C16)作为脂肪酶AFLB的底物，在最适条件下测定对该底物的酶活力。以无加入脂肪酶的酶活力作为平行对照组，以相应底物的酶活力为100%，其余的以相对酶活力表示。

2 结果与讨论

2.1 脂肪酶AFLB的序列分析

AFLB的基因扩增检测结果见图1。由图1可知，从AspergillusfumigatusGIM3.20中克隆的脂肪酶AFLB基因片段的大小与理论相符；测序结果显示，该AFLB基因片段包含1 320 bp，与NBI数据库中的基因XM_744013相应片段的一致性达到99%，其中唯一一个错配碱基是G364，对应AFLB的C295。ExPASy分析显示，该脂肪酶成熟肽含有440个氨基酸残基，理论蛋白质分子质量为46.7 Da，理论等电点为5.14； NetNGlyc分析显示，N25为潜在的N-糖基化位点。NCBI序列比对结果显示：AFLB的氨基酸序列与来自费舍尔曲霉(A.fischeriNRRL 181)的脂肪酶氨基酸序列有94% 的一致性，与乌达加瓦曲霉(A.udagawae)脂肪酶序列有92%的一致性，与A.turcosus、棒曲霉NRRL 1(A.clavatusNRRL 1)、黑曲霉(A.niger)、扩展青霉(Penicilliumexpansum)和希金斯刺盘孢菌(Colletotrichumhigginsianum)脂肪酶序列的一致性分别为83%、73%、60%、51%和45%，但这些序列均来自全基因组测序，并没有进行酶学性质研究。将AFLB序列与the Lipase Engineering Database(http://www.led.uni-stuttgart.de/)中的序列比较分析，发现AFLB 属于C.antarctica脂肪酶 B(CALB)家族成员 (abH37.01)，其中，AFLB与CALB的氨基酸序列一致性达到31%。AFLB与已报道的CALB 家族脂肪酶的序列比对结果见图2。图2表明， AFLB 含有与家族其他成员类似的保守五肽序列(SWSQG)，预测AFLB的催化三联体分别为S233、D318和H361，其中Ser233位于保守五肽序列中。CALB蛋白分子中包含三对二硫键，而AFLB可能只保留其中一对二硫键(C350-C395)。相比其他已报道的CALB家族脂肪酶，AFLB具有一段含有128个氨基酸残基的N-端延长序列(图2)，结合NCBI序列比对结果，发现该N-端延长片段为曲霉属(Aspergillus.sp)脂肪酶B的特征序列，并且该片段的具体功能有待研究。

图1 AFLB基因扩增检测结果Fig.1 Analysis of AFLB genes amplified from PCR

★：催化三联体；■： 保守五肽序列图2 脂肪酶AFLB 全序列比对结果Fig.2 Multiple sequence alignment of lipase AFLB

2.2 脂肪酶AFLB表达与纯化结果

利用甲酵诱导基因工程毕赤酵母菌(pPIC9K-AFLB-His)胞外高效表达重组脂肪酶AFLB。利用Ni Sephraose 6 FF柱层析等纯化手段，最终获得的脂肪酶AFLB蛋白质质量浓度为140 μg/mL。AFLB蛋白质表达与纯化结果见图3。图3中，SDS-PAGE检测显示，125 mmol/L咪唑洗脱的样品中，含有两条目的蛋白质条带，大条带大小为45～66 kDa，该条带可能是高度糖基化的蛋白；小条带大小约为42 kDa，与理论大小46.7 kDa有较小差距。可以推测，AFLB蛋白的N端片段被宿主酵母菌的内肽酶不完全水解，导致部分AFLB酶蛋白的N端片段(1～50位氨基酸残基)缺失；而预测的糖基化位点N25正好在被切除的片段当中，使得去掉部分N端片段的AFLB主体蛋白去糖基化并且分子质量略小于理论分子质量。

泳道1：AFLB的发酵上清液；泳道2：125 mmol/L咪唑缓冲液洗脱蛋白；泳道3：500 mmol/L咪唑缓冲液洗脱蛋白；泳道M：中低分子质量蛋白marker。图3 脂肪酶 AFLB的蛋白质表达及纯化结果Fig.3 Expression and purification of AFLB

2.3 脂肪酶AFLB的酶学性质分析

图4 pH值对脂肪酶AFLB 活性的影响Fig.4 Effects of pH values on activity of lipase AFLB

图5 温度对脂肪酶AFLB酶活性和热稳定性的影响Fig.5 Effect of temperature on activity and thermostability of lipase AFLB

脂肪酶AFLB最适反应pH值测定结果见图4。图4中脂肪酶AFLB在pH值为7.0的50 mmol/L磷酸缓冲液中水解活性最高；而pH值为7.5～9.0时，脂肪酶AFLB活性迅速下降；在pH值 5.0～7.0，AFLB的活力不低于最高活力的87.3%。脂肪酶AFLB最适反应温度与热稳定性测定结果见图5。由图5(a)可知，在最适反应pH值条件下，脂肪酶ALFB催化水解三丁酸甘油酯反应的最适温度为40 ℃，而酶在30～50 ℃条件下，水解活力达到最高活力80%以上。由图5(b)可知，AFLB在50 ℃以下相对稳定，50 ℃孵育150 min后仍保持87.9%的活力。当温度在60 ℃以上，AFLB的稳定性明显变弱。60 ℃孵育150min后，AFLB的残余酶活力只有16.8%；在70 ℃环境下孵育20 min基本可以使酶失活。有趣的是，脂肪酶AFLB在高浓度的NaCl溶液(1～6 mol/L)下孵育120 min后，仍然保存原有活力，见图6。图6表明，脂肪酶AFLB是一种耐钠盐的脂肪酶。利用对硝基苯酯作为底物研究脂肪酶AFLB底物偏好性，结果如图7所示。该酶对脂肪酸碳链长2～16的对硝基苯酯都具有水解活性，其中最适的底物是肉豆蔻酸对硝基苯酯。

图6 NaCl浓度对脂肪酶AFLB稳定性的影响Fig.6 Effects of concentrations of NaCl on stability of lipase AFLB

C2～C14：不同长度酰基的对硝基苯酯图7 脂肪酶AFLB对不同对硝基苯酯的水解活性Fig.7 Relative activity of lipase AFLB toward p-nitrophenyl esters

3 结 论

从烟曲霉AspergillusfumigatusGIM3.20中克隆得到一个CALB家族脂肪酶基因AFLB。经过对AFLB的序列分析，发现AFLB与CALB的氨基酸序列有31%的一致性，两者同属abH37.01家族，与已报道的CALB家族脂肪有着一定的亲缘关系。AFLB具有一段N-端延长片段，是曲霉属脂肪酶B的特有序列，其结构与功能关系有待下一步研究。在毕赤酵母GS115中成功对AFLB进行异源表达，并利用Ni柱亲和层析纯化得到了重组蛋白。酶学性质研究发现，重组脂肪酶AFLB最适反应pH 值为7.0，最适反应温度为40 ℃，在50 ℃以下具有较好的热稳定性，并且具有良好的钠盐耐受性，其最适底物为肉豆蔻酸对硝基苯酯。