毛蕊异黄酮-磷脂复合物的处方研究

史卓琪，刘黎瑶，，通信作者，熊倩，王庆奎

毛蕊异黄酮-磷脂复合物的处方研究

史卓琪a，刘黎瑶a，b，通信作者，熊倩a，王庆奎b

（天津农学院 a. 基础科学学院 生物制药系，b. 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

毛蕊异黄酮是从黄芪中提取分离得到的小分子异黄酮类活性化合物，可与机体的雌激素受体结合发挥显著的雌激素样作用、抗肿瘤和免疫调节等作用。但由于其脂溶性差等问题，造成制剂成型性差，体内生物利用度低。本研究旨在利用磷脂复合技术提高其脂溶性。其中，通过溶剂-旋转蒸发法，以复合率（）为筛选指标，通过单因素筛选以及正交设计，筛选得到制备毛蕊异黄酮-磷脂复合物的最佳处方。优选复合条件下，毛蕊异黄酮与大豆磷脂的复合比例为1∶5；复合溶剂为pH 6.0的无水乙醇；复合时间为60 min，在该优选处方工艺下，毛蕊异黄酮-磷脂复合率达到90%以上，4 ℃下可稳定保存3个月。该研究为毛蕊异黄酮-磷脂复合物的后期应用奠定了物质

毛蕊异黄酮；磷脂复合物；正交设计；处方筛选

毛蕊异黄酮是提取自中药黄芩、黄芪中的单体活性成分，研究表明其可与机体的雌激素受体结合，发生雌激素样作用，且具有显著的抗氧化、降血糖、抗肿瘤和免疫调节等作用[1-3]。但由于毛蕊异黄酮的极性大，脂溶性极差，导致口服给药后的生物利用度较低，无法充分发挥药物治疗作用[4-5]。因此，通过药物制剂技术构建适宜的递送载体来提高毛蕊异黄酮的脂溶性，具有极大的应用前景和价值。

磷脂复合物是通过药物和磷脂分子间的静电复合作用形成的稳定复合体，能够在不改变药物分子结构的前提下，极大程度提高药物的脂溶性，在增加中药有效成分口服生物利用度的研究方面已有较深入的研究[6-8]。已有研究将苦参总黄酮等植物黄酮类药物与磷脂形成复合物后，能显著增加药物在醇溶液中的溶解度，提高在细胞膜中的溶解性，增加肠壁的通透性，从而提高药物在肠道内的吸收率[9]。但是，在已有研究中未见毛蕊异黄酮-磷脂复合物的处方研究。因此，在本研究中，使用溶剂-旋转蒸发法，在适宜的复合溶剂中，通过单因素试验以及正交设计，以毛蕊异黄酮与大豆卵磷脂的复合率为筛选指标，对复合溶剂的pH值、复合时间及投料比例进行了考察，在优选的复合处方工艺中，复合溶剂为无水乙醇，溶剂系统的最适pH值为6.0，复合时间为60 min，毛蕊异黄酮与磷脂的投料质量比例为1∶5。按照优选处方所制备的毛蕊异黄酮-磷脂复合物的复合率达到90%以上。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

电子天平（Sartorius，BSA 223S）；旋转蒸发仪（Rotavapor R-100，BUCHI）；超声波清洗仪（昆山禾创仪器有限公司，KH5200B型）；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；微孔滤膜等。

1.2 试药

毛蕊异黄酮（成都普瑞法科技开发有限公司，纯度98%）；毛蕊异黄酮标准品（中国药品生物制品检定院，HPLC≥99%）；大豆磷脂（上海艾伟拓医药科技有限公司，纯度98%）；无水乙醇、正己烷、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷（天津市风船化学试剂有限公司，分析纯）；磷酸、氢氧化钠等其他试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 毛蕊异黄酮-磷脂复合物的制备方法

分别称取适量毛蕊异黄酮与大豆卵磷脂置于烧杯中，加入适宜溶剂分别溶解后，混合并振摇均匀，封口。置于震荡条件下进行复合反应。复合结束后，减压蒸发多余溶剂，即得干燥的黄色固体颗粒状毛蕊异黄酮-磷脂复合物。

2.2 毛蕊异黄酮-磷脂复合物的复合率测定方法建立

2.2.1 紫外-可见光区全波长扫描

称取毛蕊异黄酮标准品10 mg置于容量瓶中，加入无水乙醇超声溶解并稀释至适当浓度后，使用紫外-可见分光光度计测定其在200～900 nm波长区域内的紫外-可见光吸收情况，并记录该区域内的扫描光谱图。根据全波长扫描光谱图选择含量测定的最适波长。

2.2.2 标准曲线绘制

准确称量毛蕊异黄酮标准品10 mg置于容量瓶中，加入无水乙醇超声溶解并定容至100 mL，配制得到浓度为100 μg/mL的储备液。精密移取适量储备液，并使用无水乙醇稀释得到1、5、8、10、15 μg/mL梯度浓度的标准溶液。通过紫外分光光度法，在最适吸收波长条件下，测定上述系列标准溶液的吸光度。以质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并通过最小二乘法拟合出线性回归方程。

2.2.3 精密度测定

取2.2.2部分低、中、高浓度的线性样品连续测定5次，测定其在最适波长下的吸光度，记录吸光度数值并计算相对标准偏差（）。

2.2.4 复合率的测定方法

利用毛蕊异黄酮不溶于正己烷，成功形成毛蕊异黄酮-磷脂复合物后则易溶于正己烷的特性[10-11]，在样品制备结束后，称取适量样品置于烧杯中，加入适量正己烷溶解，经微孔滤膜过滤之后，收集滤液并减压蒸发去除多余正己烷，使用无水乙醇溶解并稀释适宜倍数，于最适吸收波长条件下，测定其中毛蕊异黄酮的吸光度，使用标准曲线的回归方程，计算复合物中毛蕊异黄酮的含量。根据初始投料量（0）与复合物中毛蕊异黄酮的质量（t）计算复合率（），计算公式为：（%）＝t/0×100%。

2.3 单因素影响试验

2.3.1 反应溶剂筛选

根据文献调研[9]和前期试验结果，在本项研究中，首先对复合反应的溶剂系统进行了筛选。设定了毛蕊异黄酮与磷脂的投料比为1∶10（质量比例，下同），复合时间为60 min。以毛蕊异黄酮-磷脂复合物的复合率为评价指标，对甲醇、无水乙醇、二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷、四氢呋喃进行考察，以筛选出最佳的复合溶剂。

2.3.2 溶剂系统pH值筛选

选定复合溶剂之后，对该复合溶剂系统的pH值进行筛选，在筛选的过程中保持毛蕊异黄酮与磷脂的投料比为1∶10，复合时间为60 min。设定溶剂系统的pH值为1.0、3.0、5.0、6.0、8.0、10.0，以复合率为评价指标，筛选出反应溶剂系统的最佳pH值。

2.3.3 投料比例筛选

使用选定的复合溶剂，并且在选定的pH条件下，保持复合反应为60 min。以毛蕊异黄酮-磷脂复合物的复合率为评价指标，设定毛蕊异黄酮与磷脂的投料比为1∶1、1∶3、1∶5、1∶8、1∶10，对毛蕊异黄酮与磷脂的投料比例进行筛选。

2.3.4 超声反应时间筛选

使用选定的复合溶剂，并且在选定的pH条件及投料比例下，以毛蕊异黄酮-磷脂复合物的复合率为评价指标，设定复合时间分别为5、15、30、60、90 min，对复合时间进行筛选。

2.4 正交设计试验

根据单因素试验结果，选择最佳反应溶剂系统为无水乙醇，复合反应受到溶剂系统pH值（A）、毛蕊异黄酮与磷脂的投料比例（B）、复合时间（C）的影响。因此，进行上述3因素3水平的正交试验，以复合率为指标筛选出最佳的处方工艺。正交设计因素水平表如表1所示。

表1 正交设计因素水平表

水平溶剂系统pH值（A）投料比例（B）复合时间（C） WCaly：W磷脂min 15.01∶315 26.01∶530 38.01∶860

2.5 优化处方下复合物的放置稳定性

在优选的处方工艺下，制备3批毛蕊异黄酮-磷脂复合物，分别测定其复合率，并且于4 ℃条件下密封放置0、1、2、3个月，对该优选处方下放置稳定性进行评价。

3 结果与分析

3.1 毛蕊异黄酮的含量测定方法

3.1.1 全波长扫描

按照既定试验方法，使用紫外-可见分光光度计测定毛蕊异黄酮溶液在200～900 nm波长区域内的紫外-可见光吸收情况，并记录该区域内的扫描光谱图，如图1所示。根据全波长扫描光谱图选择含量测定的最适波长为290 nm。

图1 毛蕊异黄酮溶液的全波长扫描光谱图

3.1.2 标准曲线绘制

按照既定的试验方法，配制不同浓度毛蕊异黄酮标准品系列溶液，使用紫外分光光度法测定其在290 nm波长处的吸光度。结果表明：以吸光度Abs（纵坐标，）对浓度c（μg/mL，横坐标，）进行线性回归，拟合得出的回归方程为＝0.052 2＋0.008 9（2＝0.999 3），毛蕊异黄酮标准品系列溶液在0～15 μg/mL浓度范围内线性关系良好，如图2所示。

图2 毛蕊异黄酮标准品系列溶液标准曲线

3.1.3 精密度测定

按照既定的试验方法，低、中、高浓度毛蕊异黄酮标准品溶液的精密度测定结果如表2所示。

表2 精密度试验结果

浓度A1A2A3A4A5`A±SDRSD μg·mL-1% 1.00.087 30.087 90.087 80.087 60.087 60.087 6±0.000 20.26 8.00.446 10.446 30.445 80.445 90.445 80.446 0±0.000 20.05 15.00.775 10.775 20.775 10.775 50.775 30.775 2±0.000 20.02

注：为待测溶液在290 nm处的吸光度数值；为标准偏差；（%）为相对标准偏差

测定结果表明：对低、中、高浓度对照品溶液分别连续重复5次测定的值均小于2%，表明本法的精密度良好。

3.2 单因素影响试验

3.2.1 反应溶剂筛选

根据既定试验方法，以毛蕊异黄酮-磷脂复合物的复合率为评价指标，对甲醇、无水乙醇、二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷、四氢呋喃进行考察，以筛选出最佳的反应溶剂，筛选结果如图3所示。分析结果表明：使用无水乙醇以及甲醇-二氯甲烷的溶剂系统制备毛蕊异黄酮-磷脂复合物时，复合率均高于其他几种溶剂，但考虑到试剂的毒性，选择了无水乙醇作为复合反应溶剂。

图3 复合溶剂筛选结果

3.2.2 溶剂系统pH值筛选

根据既定试验方法，在筛选的过程中保持毛蕊异黄酮与磷脂的投料比为1∶10，超声复合时间为60 min，并以无水乙醇作为复合溶剂。以复合率为评价指标，筛选出复合溶剂系统的最佳pH值，筛选结果如图4所示。

分析结果表明：当复合溶剂系统的pH值从1.0升高至6.0时，复合率逐渐升高；pH为6.0时复合率达到最高，随后便开始降低。

图4 溶剂系统pH值的单因素筛选结果

3.2.3 投料比例筛选

根据既定试验方法，保持溶剂系统的pH值为6.0、复合时间为60 min条件下，以毛蕊异黄酮-磷脂复合物的复合率为评价指标，对毛蕊异黄酮与磷脂的投料比例进行筛选，结果如图5所示。

分析结果表明：随着磷脂用量的增加，复合率呈现增长的趋势，并且在1∶3之后逐渐趋近于复合平衡，复合率基本达到90%左右。

图5 毛蕊异黄酮与磷脂的投料比例（质量比例）单因素筛选结果

3.2.4 复合反应时间筛选

在选定的反应溶剂、选定的pH条件及投料比例下，以毛蕊异黄酮-磷脂复合物的复合率为评价指标，对复合时间进行筛选，筛选结果如图6所示。分析结果表明：当复合时间为15 min时，复合率即达到90%以上，之后，随着超声时间增加，未见复合率进一步显著增加。

图6 复合时间的单因素筛选结果

3.3 正交设计试验

通过3因素3水平（L9，34）正交设计，复合率作为评价指标，对溶剂系统pH值（A）、毛蕊异黄酮与磷脂的投料比例（B）、复合时间（C）进行正交筛选，得出制备毛蕊异黄酮-磷脂复合物的最佳处方，正交分析结果如表3所示。

表3 处方筛选的正交试验结果

样品编号溶剂系统pH值（A）投料比例（B）复合时间（C）复合率 WCaly：W磷脂min% 111170.7 212278.1 313376.3 421270.7 522395.2 623193.4 731342.3 832140.7 933237.6 k 175.03361.23368.267 k 286.43371.33362.133 k 340.20069.10071.267 R46.23310.100 9.134

分析结果表明：在影响该磷脂复合物复合率的三大因素中，溶剂系统pH值对复合率的影响较大，其次是复合时间与投料比例。通过正交极差分析得出最优的处方为A2B2C3，即溶剂系统pH值为6.0、毛蕊异黄酮与磷脂的质量比例为1∶5、复合时间为60 min。

3.4 优化处方下磷脂复合物的稳定性评价

按照最优处方条件制备了3批毛蕊异黄酮-磷脂复合物，并且对其放置稳定性进行了初步的稳定性评价表征，结果如表4所示。考察结果表明：优选处方下制备的3批毛蕊异黄酮-磷脂复合物的复合率为（93.7±1.42）%，外观呈黄色干燥颗粒状。将上述3批复合物置于4 ℃条件下进行放置稳定性评价，结果表明：优选处方下毛蕊异黄酮-磷脂复合物放置3个月内稳定性良好，复合率以及毛蕊异黄酮含量均未发生显著变化。

表4 毛蕊异黄酮-磷脂复合物的放置稳定性评价（4 ℃）

评价项目0个月1个月2个月 复合率/%93.7±1.4292.8±2.5990.3±3.46 含量/%16.83±0.1716.74±0.5216.53±0.12 外观干燥黄色颗粒状物干燥黄色颗粒状物干燥黄色颗粒状物

4 讨论

根据形成机制，磷脂复合物是以磷脂作为分散载体（或者分散介质），通过适宜的方法制备的一类固体分散体，其中，活性药物以无定形的状态均匀分散在分散载体中，能显著改善难溶性药物的溶解性、溶解速度及生物利用度[10]。根据药物的性质，可通过多种方法来制备磷脂复合物，包括冷冻干燥法、熔融法等[11-12]。本研究通过筛选适宜的复合溶剂系统及工艺条件，首次制备成功毛蕊异黄酮-磷脂复合物，有望为其进一步应用提供理论基础，具有很大的发展空间以及实际应用价值。但是，在本研究中尚未对复合机制进行深入研究和阐述，将在后续研究中进行。

本研究中，发现在毛蕊异黄酮-磷脂复合物复合率的限制因素中，当毛蕊异黄酮与磷脂的质量比例为1∶3时，复合率即可达到90%左右，这可能与毛蕊异黄酮是小分子量的黄酮化合物有关。研究表明，形成磷脂复合物时，药物分子中的羰基会与磷脂分子中的羟基形成氢键[13-15]，或者通过范德华力形成弱键连接。毛蕊异黄酮中仅有1个羰基，因此，形成磷脂复合物时所需的磷脂分子数量较少，宏观表现为复合时所需的磷脂质量较少。

在试验过程中，发现复合溶剂系统的pH值对于复合率的影响最大。事实上，在制备过程中发现，如果溶剂的pH值偏离5.0～8.0时，大量的毛蕊异黄酮沉淀在底部，无法与磷脂溶液进行复合，导致毛蕊异黄酮-磷脂复合物基本不能复合成型。这可能是由于改变或调节pH值时加入的某些离子，影响了毛蕊异黄酮在有机溶剂中的溶解性，导致其无法在均一的溶液中以分子状态与磷脂分子发生复合作用。因此，在后续的研究中，有必要针对难溶性药物的溶解状态与复合率的关系进行相关研究。

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Formulation optimization of calycosin phospholipid complex

SHI Zhuo-qia, LIU Li-yaoa,b,Corresponding Author, XIONG Qiana, WANG Qing-kuib

（Tianjin Agricultural University, a. Department of Biopharmaceuticals, College of Basic Science; b. Tianjin Key Lab of Aquatic Ecology and Aquaculture, Tianjin 300384, China）

Calycosin is an active substance extracted and separated from. It could combine with estrogen receptor and generate estrogen-like action, antitumor and immunoregulation effect. However, because of its poor lipophilicity, it is difficult to be utilized in medical preparation. And itsbioavailability is usually extremely low. This study was designed to increase the lipophilicity of calycosin using phospholipid complexation technology. In this study, associative efficiency（）was set as screening parameter and optimal formulation of calycosin phospholipid complex was obtained using solvent evaporation method based on single factor screening and orthogonal design. Under the selected formulation, mass ratio of calycosin to phospholipid was 1∶5 and composite time was 60 minutes in ethanol of pH 6.0. For the selected formulation,of calycosin phospholipid complex could reach 90% and storage stability remained in 3 months under 4 ℃. Compared with calycosin material medicine, the lipophilicity of phospholipid complex was increased by 600 times, which provides the basis for practical application.

calycosin; phospholipid complex; orthogonal screening; formulation optimization

1008-5394（2019）04-0077-06

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.016

基础。

P641.131；S152.72

A

2019-1-13

天津市教委科研计划项目（2017KJ181）；天津市水产产业技术体系创新团队项目（ITTFRS2017004）；国家自然科学基金面上项目（31170442）

史卓琪（1997-），女，本科在读，主要从事药物制剂方面的研究。E-mail：894309228@qq.com。

刘黎瑶（1988-），女，讲师，博士，主要从事药物制剂方面的研究。E-mail：llymeilin@163.com。

责任编辑：张爱婷