HPLC法检测鸡蛋中DHA-EE和EPA-EE含量的条件优化

潘黎，于晓雪，孟玉芳，程学放，李冰洁，卢思沛，代昕彤，李留安，金天明

HPLC法检测鸡蛋中DHA-EE和EPA-EE含量的条件优化

潘黎，于晓雪通信作者，孟玉芳，程学放，李冰洁，卢思沛，代昕彤，李留安，金天明

（天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300384）

为利用高效液相色谱法检测衍生化鸡蛋样品中的二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）和二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE），使用super C18色谱柱，考察了流动相有机相比例、流速及柱温改变对EPA-EE和DHA-EE分离的影响，确定了等度洗脱、流动相为甲醇-水（95∶5，/）、流速1.0 mL/min、柱温30 ℃、检测波长220 nm的色谱条件。该方法下，EPA-EE和DHA-EE分别在线性范围内浓度和峰面积呈现良好的线性关系，相关系数分别为0.999 2和0.999 0，采用上述方法测定了ω-溴苯乙酮衍生化的鸡蛋中混合脂肪酸，结果表明EPA-EE和DHA-EE二峰可达到基线分离。本方法快速、简单、重复性好，为鸡蛋中多不饱和脂肪酸含量的快速检测提供了思路。

高效液相色谱法；鸡蛋；二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）；二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE）

二十碳五烯酸（EPA）被誉为“血管清洁剂”，能够调节血脂、降低血液黏稠度，预防血栓形成，还可以降血压，保护心脑血管健康及肾脏功能。二十二碳六烯酸（DHA），俗称“脑黄金”，是人脑的主要组成物质之一，约占人脑脂质的10%，近期也有研究表明DHA可改善心脑血管病和抑郁症，发挥免疫调节作用[1-4]。EPA和DHA都属于ω-3 多不饱和脂肪酸，在人体内的合成不能满足自身需要，需由食物供给。鸡蛋中含有较高的蛋白质、脂类、多种氨基酸及矿物质元素等，营养丰富且价格低，因此被世界各地的人们广泛食用[5]。但普通鸡蛋中DHA和EPA含量较少，当前市场上通过各种添加剂生产的富含EPA和DHA的功能禽蛋产品应运而生，深受消费者欢迎，因此迫切需要建立起测定鸡蛋中EPA和DHA含量的快速有效方法[6-8]。

EPA 和DHA 不稳定，最近研究显示在保健品中其被制作为纳米乳来提高稳定性[9]。二者在自然界通常是以甘油三酯形态存在的，通过有机溶剂提取天然形态的甘油三酯型效率低下，且由于缺少商业化甘油三酯型EPA和甘油三酯型DHA标准品，因此通常采用乙酯化[10-11]。本试验将用稳定性更好的乙酯化形式——二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）和二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE）来替代。目前鸡蛋中多不饱和脂肪酸含量的检测技术都采用气相色谱法，对样品的处理程序较复杂、耗时较长[12-14]。

本试验拟比较流动相、流速、柱温等条件改变对EPA-EE和DHA-EE分离效果的影响，并检测方法的精密度、重复性及样品回收率，为建立简单、快速、准确地检测鸡蛋中多不饱和脂肪酸含量的高效液相色谱法提供试验证据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

Agilent1260 HPLC高效液相色谱仪（美国，Agilent公司）；ACE Super C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，50 mm×4.6 mm保护柱，广州菲罗门科学仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水纯化系统（默瑞（上海）生物科技有限公司）；分析天平（奥豪斯国际贸易（上海）有限公司）；氮吹仪（美国，Organomation公司）。

1.1.2  试剂

二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE）标准品、二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）标准品，购自上海安谱实验科技股份有限公司；色谱级甲醇和乙腈，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；三乙胺（色谱级），购自上海安谱试验科技股份有限公司；ω-溴代苯乙酮（分析纯，玛雅试剂）；丙酮（分析纯）；三氯甲烷（分析纯），购自利安隆博华（天津）医药化学有限公司；无水乙醇（色谱纯），购自天津市风船化学试剂科技有限公司；氢氧化钾，购自博欧特（天津）化工贸易有限公司；纯净水，购自杭州娃哈哈集团有限公司；氮气；双蒸水；0.22 μm滤膜及0.2 μm注射器过滤头，天津市科亿隆实验设备有限公司。

1.2 标准曲线的建立、检测限与定量限

1.2.1 标准曲线的建立

使用色谱甲醇分别将 EPA-EE标准品和DHA-EE标准品配制成100 mg/mL的储液，并梯度稀释成100、200、400、800、1 000、1 500、2 000 μg/mL。将以上2个系列、7个不同浓度的标准品溶液分别进样。每个样品精确进样20 μL，按选定色谱条件测定，采用峰面积对其浓度作标准曲线。

1.2.2 检出限与定量限

将建立标准曲线的EPA-EE标准品和DHA-EE标准品溶液逐级稀释，用于测定检出限、定量限，当信噪比（S/N）为3 时样品浓度为检出限；当信噪比（S/N）为10 时样品浓度为定量限。

1.3 流动相、流速、柱温的选择与优化

在相同流速、柱温条件下，考察不同比例甲醇-水（95%、90%）、乙腈-水（85%、90%、95%）作为流动相时，对EPA-EE和DHA-EE分离效果的影响；在相同流动相、流速条件下，考察了不同柱温（30、35、40 ℃）对EPA-EE和DHA-EE分离效果的影响；在相同流动相、柱温条件下，考察了不同流速（0.8、1.0、1.5 mL/min）对EPA-EE和DHA-EE分离效果的影响。

1.4 精密度、重复性、回收率试验

分别取浓度均为2 000 μg/mL的EPA-EE 和DHA-EE标准品溶液，精密吸取20 μL进样，连续进样6次，考察仪器的精密度。

分别取EPA-EE 和DHA-EE 储备液，配制浓度均为1 000 μg/mL的供试品溶液各6 份，精密吸取20 μL 进样进行测定，分别计算EPA-EE和DHA-EE 的重复性。

取EPA-EE标准品27.32 μg加入到烘干蛋样0.5 g中，另外取DHA -EE标准品303.92 μg加入烘干蛋样0.5 g中，每组设6个重复，按照1.5中步骤进行脂肪酸提取与酯化后，作为供试品溶液进行测定，计算回收率。由于1.5步骤最终定容体积为2 mL，因此EPA-EE标准品的添加水平相当于13.66 μg/ mL，DHA-EE标准品的添加水平相当于151.96 μg/ mL。

1.5 鸡蛋中脂肪酸的提取与酯化

新鲜鸡蛋的蛋黄蛋清分离后，取蛋黄搅匀、烘干，精确称取1 g，加入3 mL混合溶剂（氯仿：甲醇＝1∶2），搅拌2 min；加氯仿5 mL，搅拌30 s；加蒸馏水5 mL，搅拌30 s；抽滤，用少量氯仿洗涤残渣；待滤液静置分层，分离去除溶剂，得油层；加入4 mL 0.5 mol/L KOH-乙醇溶液，充氮气后在60 ℃水浴中加热30 min；冷却后加入1滴酚酞指示剂；HCL-乙醇滴定至终点；分离上清，氮气吹干。样品加入0.2 mL三乙胺的丙酮溶液（10 g/L）及0.4 mLω-溴苯乙酮溶液（10 g/L）；充入氮气，60 ℃水浴加热15 min；冷却后定容至2 mL。所有样品包括标准品，采用高效液相色谱法检测都需经0.2 μm注射器滤膜过滤后上样。

1.6 数据分析

采用Microsoft Excel软件进行试验数据的整理和计算。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择与优化

相同流速、相同柱温（1 mL/min、30 ℃）下，分别考察了以甲醇-水与乙腈-水为流动相时的分离效果，结果如图1所示，使用乙腈-水（95∶5，/）、乙腈-水（90∶10，/）、乙腈-水（85∶15，/）和甲醇-水（95∶5，/）、甲醇-水（90∶10，/）的流动相时，EPA-EE和DHA-EE的峰都能达到基线分离，达到分析要求。

图1 相同流速、相同柱温、不同流动相下EPA-EE与DHA-EE的色谱图谱

注：a. 乙腈-水（95∶5，/）；b. 乙腈-水（90∶10，/）；c. 乙腈-水（85∶15，/）；d. 甲醇-水（95∶5，/）；e. 甲醇-水（90∶10，/）

2.2 流速的选择

使用甲醇-水（95∶5，/）为流动相，柱温为30 ℃，分别检测流速为1.0 mL/min和1.5 mL/min时EPA-EE和DHA-EE的分离情况。结果如图2所示，2种流速下EPA-EE和DHA-EE都能完全达到基线分离，流速增加，柱压也随之增高，从101增加至15 200 KPa；样品保留时间缩短，其中EPA-EE的保留时间由11.775 min缩短至7.895 min，DHA-EE的保留时间由13.893 min缩短至9.319 min。考虑到保留时间、后续检测鸡蛋提取脂肪酸样品杂质等因素，流速定为1.0 mL/min。

图2 流动相和柱温不变，流速改变对EPA-EE和DHA-EE分离效果的影响

注：a. 流速为1.0 mL/min；b. 流速为1.5 mL/min

2.3 柱温的选择

使用甲醇-水（95∶5，/）为流动相，流速为1.0mL/min，检测柱温为30、35、40 ℃时EPA-EE和DHA-EE的分离情况。结果如图3所示，3种柱温下EPA-EE和DHA-EE都能完全达到基线分离。随着柱温增加（30～40 ℃），EPA-EE和DHA-EE的保留时间均缩短1～2 min。考虑到保护脂肪酸样品稳定性等因素，柱温定为30 ℃。

图3 流动相和流速不变，柱温改变对EPA-EE和DHA-EE分离效果的影响

注：a. 柱温为30 ℃；b. 柱温为35 ℃；c. 柱温为40 ℃

2.4 标准曲线的建立，检出限与定量限

以甲醇-水（95:5，/）为流动相，流速1.0 mL/min，检测柱温为30 ℃，每个稀释标准品溶液进样20 μL测定后，采用峰面积对其浓度作标准曲线，EPA-EE线性回归方程为＝8.898 5- 3.959 4（为峰面积，为样品浓度），2＝0.999 2。DHA-EE线性回归方程为＝3.468 3＋186.620 0（为峰面积，为样品浓度），2＝0.999 0。在各自浓度范围内，EPA-EE 和DHA-EE 的线性关系良好，而且线性范围较宽。

逐级稀释溶液测定检出限、定量限，当信噪比（S/N）为3 时，EPA-EE 和DHA-EE 的检出限分别为10 ng 和12 ng。当信噪比（S/N）为10 时，EPA-EE和DHA-EE 的定量限分别为44 ng 和46 ng。

表1 EPA-EE 和DHA-EE 标准品线性测定结果

成分浓度峰面积成分浓度峰面积 μg·mL-1μg·mL-1 EPA-EE1095.5DHA-EE100 427.3 20185.3200 844.9 40330.14001 656.8 80683.08003 081.9 100908.81 0003 642.3 1501 334.41 5005 390.6 2001 774.32 0007 072.5

2.5 精密度试验

分别取浓度均为2 000 μg/mL的EPA-EE 和DHA-EE标准品溶液，精密吸取20 μL进样，连续进样6次，考察仪器的精密度，EPA-EE和DHA-EE的峰面积分别为0.020%和0.018%，表明本方法的精密度良好。

2.6 重复性试验

分别取EPA-EE 和DHA-EE 储备液，配制浓度均为1 000 μg/mL的供试品溶液各6 份，精密吸取20 μL进样进行测定，分别计算EPA-EE和DHA-EE 的重复性。结果显示，EPA-EE 和DHA-EE 的重复性分别为4.32%和4.30%，表明本方法重复性良好。

2.7 回收率试验

经过样品前处理和高效液相色谱检测，EPA-EE平均回收率为89.63%，为1.15%，DHA-EE平均回收率为85.61%，为1.85%，结果见表2和表3。结果表明，本方法回收率良好。

表2 EPA-EE回收率测定结果

成分添加水平检测水平回收率平均回收率RSD μg·mL-1μg·mL-1%%% EPA-EE13.6612.0087.8889.631.15 12.3890.60 12.2989.95 12.3989.87 12.2789.86 12.8594.10

表3 DHA-EE回收率测定结果

成分添加水平检测水平回收率平均回收率RSD μg·mL-1μg·mL-1%%% DHA-EE151.96131.7986.7285.611.85 127.1783.69 130.1785.66 127.1183.65 132.4587.16 131.9086.80

2.8 衍生化鸡蛋样品中EPA-EE与DHA-EE检测

对鸡蛋样品进行提取脂肪酸和衍生化，采用流动相为甲醇-水（95∶5，/）等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长220 nm的方法测定。结果如图4所示，该方法可以分离EPA-EE和DHA-EE的峰。

图4 鸡蛋样品衍生化脂肪酸中EPA-EE和DHA-EE的检测结果

3 讨论

3.1 高效液相色谱条件的选择和优化

在研究制定一个高效液相色谱方法时，选择适宜的流动相很重要[15]。根据参考文献报道[16-18]，考察了甲醇-水和乙腈-水作为流动相时的分离效果，较高比例有机相都能使DHA-EE和EPA-EE分离，且峰形对称性较好。考虑到生物样本的成分复杂性，选择两个峰保留时间间隔适中的甲醇-水（95∶5，/）进行后续条件的进一步优化。

柱温和流速改变对DHA-EE和EPA-EE的分离效果也有一定的影响，主要是随着柱温升高或流速变大，保留时间缩短，其中柱温改变对柱压影响不大，而流速变大使得柱压变大。鉴于保护鸡蛋脂肪酸样品的稳定性，本试验使用了柱温30 ℃、流速1.0 mL/min的条件。

3.2 鸡蛋样品的衍生化处理

EPA和DHA在鱼油或鸡蛋中通常是以甘油三酯形态存在的，通过有机溶剂提取天然形态的甘油三酯型效率较低。高效液相色谱法或气相色谱法检测脂肪酸时通常进行甲酯化或乙酯化来提高其稳定性，因此本试验将鸡蛋脂肪酸提取后，利用乙醇酯化样品使其变为乙酯化形态进行检测[13, 19-21]。在检测鸡蛋样品时，峰型尖锐度欠佳，需要进一步试验予以改善，例如调节流动相的pH值。

综上所述，本试验中使用等度洗脱、流动相为甲醇-水（95∶5，/）、流速1.0 mL/min、柱温30 ℃、检测波长220 nm的色谱条件，能够快速稳定测定出ω-溴苯乙酮衍生化的鸡蛋样品中的EPA-EE和DHA-EE，为进一步优化检测方法提供了一定的基础和依据。

[1] 龙烁，王浩，武书庚，等. 二十二碳六烯酸的生理学功能及其在家禽生产中的应用[J]. 动物营养学报， 2017，29（4）：1101-1109.

[2] Chang J P，Chang S S，Yang H T，et al. Omega-3 polyunsaturated fatty acids（n-3 PUFAs）in cardiovascular diseases comorbid major depressive disorder（MDD）- results from a randomized controlled trial[J]. Brain Behavior and Immunity，2019，3：12.

[3] Choi M，Baek J Y，Park I，et al. Moderating effect of synthesized docosahexaenoic acid-enriched phosphatidy lcholine on production of Th1 and Th2 cytokine in lipopolysaccharide-induced inflammation[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine，2018，7（8）：340-344.

[4] Zhang Y R，Min J X，Zhang L J. Anti- inflammatory and immunomodulatory effects of marine n-3 polyunsaturated fatty acids on human health and diseases[J]. Journal of Ocean University of China，2019，18（2）：481-492.

[5] 环球网. 鸡蛋可促进脑发育用作婴幼儿辅食营养高[J]. 中国食品学报，2018，18（1）：269.

[6] 胡涛，刘春雪，洪平. 高n-３多不饱和脂肪酸鸡蛋的开发研究进展[J]. 粮食与饲料工业，2018（4）：39-43.

[7] 王钧艺，闫研，金辉东，等. 二十二碳六烯酸复合添加剂对蛋鸡生产性能及蛋品质的影响[J]. 吉林畜牧兽医， 2018，39（1）：5-8，12.

[8] 王浩. 胆碱和裂殖壶菌油对鸡蛋中二十二碳六烯酸富集的影响[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2018.

[9] Zhang L，Zhang F，Fan Z K，et al. DHA and EPA nanoemulsions prepared by the low-energy emulsification method：Process factors influencing droplet size and physicochemical stability[J]. Food Research International， 2019，121：359-366.

[10] 陈伟珠，晋文慧，洪专，等. 超高压液相色谱法测定鱼油中的二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯[C]//福建省海洋学会.福建省海洋学会2012年学术年会论文集. 福建：福建省海洋学会，2013：10.

[11] 董青，李敏，杨亦文，等. EPA和DHA的分离研究进展[J].中国油脂，2019，44（1）：15-20.

[12] 中华人民共和国农业部农产品质量安全监管局. 蛋与蛋制品中ω-3多不饱和脂肪酸的测定气相色谱法：NYT 2068-2011[S]. 北京：中国农业出版社，2011：1-5.

[13] 沈勇，王建发，郭丽，等. 亚麻籽对鸡蛋蛋黄中DHA和EPA含量的影响[J]. 营养学报，2012，34（1）： 50-54.

[14] 孙丽华，肖秋霞. 鸡蛋ω-6和ω-3脂肪酸含量检测及强化研究[J]. 广东饲料，2015，24（7）：39-42.

[15] 徐红，侯健. 高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法[J]. 计量与测试技术，2010，37（2）：10.

[16] 彭宏伟，张博，杨小川，等. HPLC法测定魟鱼鱼油中二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸的含量[J]. 中国药房， 2010，21（13）：1228-1230.

[17] 张侃，曾琳，龙在云，等. 必需脂肪酸对大鼠脑组织中EPA、DHA含量的影响及意义[J]. 第三军医大学学报，2005（12）：1213-1215.

[18] 李仲玉，刘培峰，李佳凝，等. 影响畜禽肌肉肌苷酸含量的因素及其相关基因的研究进展[J]. 中国饲料， 2017（3）：8-11，19.

[19] Charlotte B，Lemahieu C，Fraeye I，et al. 蛋鸡饲料中添加微藻对鸡蛋ω-3脂肪酸含量的影响[J]. 饲料博览，2013（8）：13.

[20] 卢建，曲亮，李守龙，等. 水飞蓟油对蛋鸡产蛋性能、蛋品质及鸡蛋脂肪酸组成的影响[J]. 动物营养学报， 2015，27（12）：3831-3839.

[21] 吴永保，闫海洁，蔡辉益，等. 富含n-3多不饱和脂肪酸功能性原料在家禽生产中的应用研究进展[J]. 中国家禽，2015，37（24）：37-43.

Optimization of determination condition of DHA-EE and EPA-EE in eggs by high performance liquid chromatography（HPLC）

PAN Li, YU Xiao-xueCorresponding Author, MENG Yu-fang, CHENG Xue-fang, LI Bing-jie, LU Si-pei, DAI Xin-tong, LI Liu-an, JIN Tian-ming

（Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

To detect the content of ethyl eicosapentaenoate（EPA-EE）and ethyl docosahexaenoate（DHA-EE）in derived egg samples by high performance liquid chromatography（HPLC）, the super C18chromatographic column was used to investigate the effects of proportion of organic phase, flow rate and column temperature on separation of EPA-EE and DHA-EE. The optimal chromatographic conditions were determined: isocratic elution, mobile phase of methanol and water（95:5,/）, flow rate of 1.0 mL/min, column temperature 30℃, detection wave length of 220 nm. Through this method, the concentration and peak area of EPA-EE and DHA-EE showed a good linear relationship, and the correlation coefficient2were 0.999 2 and 0.999 0 respectively. And then the separate peaks of EPA-EE and DHA-EE in derived egg samples were detected. This method is rapid, simple and reproducible, and it provides ideas for the rapid detection of polyunsaturated fatty acids in eggs.

high performance liquid chromatography（HPLC）; eggs; ethyl eicosapentaenoate（EPA-EE）; ethyl docosahexaenoate（DHA-EE）

1008-5394（2019）04-0061-06

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.013

S879.3

A

2019-05-07

国家自然科学基金项目（31702223）；天津市大学生创新训练项目（201710061096）；天津市“131”创新型人才团队项目（20180318）；天津市科技重大专项与工程项目（18ZXBFNC00310）；天津市企业科技特派员项目（19JCTPJC59500）

潘黎（1995-），男，本科在读，主要从事畜禽兽医学研究工作。E-mail：1240734652@qq.com。

于晓雪（1990-），女，讲师，博士，主要从事畜禽兽医学研究工作。E-mail：yuxiaoxue1990@163.com。

责任编辑：张爱婷