桔梗茎叶总皂苷的提取工艺△

蒋征奎，李晓，王学方

1.郑州大学附属肿瘤医院(河南省肿瘤医院)，河南 郑州 450000；2.河南省植物天然产物开发工程技术研究中心，河南 郑州 450002

桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，是我国传统的四十种大宗中药材之一，最早载于《神农本草经》。其性平，味苦、辛，归肺经，具有宣肺利咽、祛痰排脓之功效，临床常用于咳嗽痰多、咽痛、音哑、胸闷不畅等[1]。桔梗中含有大量的三萜皂苷，生物活性研究表明，桔梗皂苷具有祛痰、抗氧化、保肝、降糖、抑制脂肪吸收、抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用[2-4]。

桔梗为多年生草本植物，一般种植2～3年后收获地下根，而桔梗茎叶作为非入药部位多废弃不用，造成资源浪费。有研究表明，桔梗茎叶中总皂苷含量高于桔梗根中总皂苷的含量[5]，与桔梗根相比，桔梗茎叶的祛痰作用在一定范围内随着浓度的增加明显增强[6]；桔梗茎叶总皂苷具有明显的抗肿瘤作用，对免疫器官也有一定的保护作用[7]；另外，桔梗茎叶还具有一定的抗炎活性[8]。目前对桔梗茎叶皂苷的提取未见研究报道，本实验以桔梗茎叶为原料，采用正交设计优化其最佳提取工艺，并进一步采用大孔吸附树脂技术优化了桔梗茎叶皂苷分离纯化工艺，旨在为桔梗茎叶的综合开发利用与桔梗茎叶皂苷的深入研究提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪、AUW220D十万分之一天平(日本岛津)；Alltech ELSD2000ES蒸发光检测器(美国奥泰)；JJ5000A型电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；HGJR-01红外加热仪(河南中良科学仪器有限公司)；LGJ-12低温冷冻干燥仪(北京松源华兴科技发展有限公司)；SB-1100旋转蒸发仪(东京理化)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂

桔梗皂苷D对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111851-201406，纯度96.2%)；D101、AB-8、HPD750、NKA-9大孔吸附树脂(天津市光复精细化工研究所)；柱层层析硅胶(100～200目)(青岛海洋化工厂分厂)；甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水、蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

桔梗茎叶，采自河南三门峡卢氏县，经河南大学张保国教授鉴定为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的茎叶。

2 方法与结果

2.1 桔梗总皂苷与桔梗皂苷D的测定

2.1.1 桔梗茎叶总皂苷的测定 取桔梗茎叶提取物2.0 g，精密称定，加水50 mL使溶解，用水饱和正丁醇萃取4次，每次用量分别为100、50、50、50 mL，合并正丁醇液，减压干燥，得桔梗茎叶总皂苷提取物[9]，精密称定，计算总皂苷含量。

(1)

2.1.2 桔梗皂苷D的含量测定 色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(25∶75)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按桔梗皂苷D峰计算应不低于30 000。

对照品溶液的制备：精密称定桔梗皂苷D对照品18.75 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，溶解后定容至刻度，即得对照品溶液，其中桔梗皂苷D的质量浓度为0.75 mg·mL-1。

供试品溶液的制备：精密称取桔梗茎叶总皂苷提取物0.2 g，至5 mL容量瓶中，加甲醇溶解后，再加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。

含量测定：分别吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得桔梗皂苷D含量。见图1～2。

图1 桔梗皂苷D的HPLC图

图2 供试品中桔梗皂苷D的HPLC图

2.1.3 方法学考察 线性关系考察：精密称取一定量的桔梗皂苷D对照品，制成桔梗皂苷D的质量浓度分别为0.1、0.25、0.5、0.75、10.0 mg·mL-1的对照品溶液，以桔梗皂苷D进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标得其回归方程：Y=52 308.35X+10 234.54，r=0.998 9，桔梗皂苷在1.5～15 ug线性关系良好。

精密度试验：精密称取桔梗茎叶总皂苷提取物0.2 g，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件，吸取供试品溶液10 uL，重复进样6次，记录峰面积，计算桔梗皂苷D的含量。结果桔梗皂苷D的平均质量分数为2.12 mg·g-1，峰面积RSD为1.35%，表明该方法精密度良好。

稳定性试验：供试品溶液分别于制备后0、2、4、8、12、24 h，吸取该供试品溶液10 uL，进样测定，记录峰面积，计算桔梗皂苷D的含量。结果桔梗皂苷D的平均质量分数为2.10 mg·g-1，峰面积RSD为1.82%，表明供试品在24 h内稳定。

加样回收率：取已知含量的供试品溶液6份，每份加入实际质量浓度为0.75 mg·mL-1的桔梗皂苷D溶液2 mL，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件，吸取每份供试品溶液10 uL，进样测定，记录峰面积，并计算加标回收率及其RSD。计算结果为平均回收率96.50%，RSD为1.95%，说明该方法准确性良好。

2.2 正交试验优选桔梗茎叶总皂苷的提取工艺

预试验中对提取桔梗茎叶的溶媒、温度、次数等可能影响桔梗茎叶总皂苷提取的因素进行了单因素试验考察，提取溶剂考察了30%、45%、60%、75%的乙醇与水，结果桔梗总皂苷的提取率差异不大，考虑到经济环保因素，选择水为提取溶剂；提取温度考察了60、70、80、90、100 ℃(提取温度采用红外加热炉的温度传感器进行控温，控温精度为±2 ℃)，结果随着温度的增加桔梗总皂苷的转移率逐渐增加，所以选择80、90、100 ℃ 3个温度水平进行试验；提取次数考察了1、2、3、4、5次，结果提取3次后，桔梗总皂苷的提取率几乎不增加，所以选择1、2、3次进行下一步的正交试验。

根据预试验结果，结合茎叶类中药材的提取，以桔梗茎叶总皂苷含量、桔梗皂苷D的含量与转移率为指标，以提取温度(A)、加水量(B)、提取时间(C)和提取次数(D)为考察因素，采用四因素三水平正交试验优化桔梗茎叶总皂苷的提取工艺[10]，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

称取桔梗干燥茎叶，每份30 g，按照表2进行试验，提取液减压浓缩至干，称质量，计算桔梗茎叶提取物收率，按照2.1方法测定桔梗茎叶提取物中总皂苷的含量、桔梗皂苷D的含量，并计算桔梗皂苷D的转移率[11]。

表2 正交试验结果

(2)

因正交表中无空列以计算试验误差项，每次试验均各重复3次。

表3 总皂苷含量方差分析结果

表4 桔梗皂苷D的含量方差分析结果

表5 桔梗皂苷D转移率的方差分析结果

由正交试验结果与方差分析结果可知，在考察的因素水平范围内，对总皂苷含量的影响大小为D>B>C>A，其中提取次数影响较大，且有显著性影响，其次为溶剂用量、提取时间、提取温度，最佳提取条件为A3B3C3D2，即100 ℃，12倍量水，每次2 h，提取2次；对桔梗皂苷D含量的影响大小为D>A>B>C，其中提取次数影响最大，且有显著性影响，其次为提取温度、溶剂用量、提取时间，最佳提取条件为A3B1C1D2，即100 ℃，8倍量水，每次1 h，提取2次；对桔梗皂苷D转移率的影响大小为D>A>C>B，其中提取次数影响最大，且有显著性影响，其次为提取温度、提取时间、溶剂用量，最佳提取条件为A3B1C2D2，即100 ℃，8倍量水，每次1.5 h，提取2次；综上，结合成本和提取效率，确定优选出最佳方案为A3B2C2D2即100 ℃，10倍量水，每次1.5 h，提取2次。

2.3 提取验证试验

称取桔梗干燥茎叶3份，每份100 g，按照优选的工艺条件，即10倍量的水提取2次，提取温度100 ℃，每次1.5 h，提取液减压浓缩至干，称重，计算桔梗茎叶提取物收率，并测定干膏中总皂苷的含量、桔梗皂苷D的含量，并计算桔梗皂苷D的转移率，结果见表6。由结果可知，平均浸膏得率为41.4%，桔梗茎叶总皂苷的质量分数为13.16%，桔梗皂苷D的质量分数为2.08 mg·g-1，转移率为66.08%，说明该提取工艺稳定、可靠。

表6 提取验证试验结果

2.4 桔梗茎叶总皂苷的纯化

经过提取得到的桔梗茎叶提取物中含有大量的杂质，很大程度上影响了对药物疗效的评价、理化参数的测定等更深层次的研究，为了达到去除杂质、富集有效成分的目的，采用大孔吸附树脂对桔梗茎叶总皂苷进行纯化。

2.4.1 样品溶液的制备 按照已优选出的最佳提取工艺制备药液，并测定桔梗茎叶总皂苷的含量。

2.4.2 树脂的预处理 为除去树脂中的部分杂质，试验前先将大孔吸附树脂用95%乙醇浸泡，充分溶胀24 h，湿法装柱(径高比1∶7)，先用95%的乙醇清洗，直至洗出液加等量的蒸馏水不产生白色浑浊为止，再用蒸馏水冲洗，至无醇味且水液澄清，则预处理完毕，备用。

2.4.3 大孔吸附树脂的筛选[12]

2.4.3.1 采用动态-吸附试验筛选树脂 准确称取已处理好的4种大孔树脂，分别为D101、AB-8、HPD750、NKA-9各50 g，蒸馏水湿法上柱(径高比1∶7)。取经离心处理的桔梗茎叶水提取液100 mL上柱，质量浓度为每mL含桔梗茎叶提取物0.4 g，以1.0 mL·min-1的流速吸附，吸附3 h后，收集过柱液，减压浓缩至干，按上述2.1方法，测定桔梗茎叶总皂苷的量，并计算各树脂的动态吸附率，结果见表7。

动态吸附率(%)=(上柱液中总皂苷量-流出液中总皂苷量)/上柱液中总皂苷量×100%

(3)

2.4.3.2 动态-解吸试验筛选树脂 将2.4.3.1中充分吸附后的树脂用蒸馏水洗脱至无色，改用70%乙醇洗脱至无色，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至干，按上述2.1方法测定桔梗茎叶总皂苷的量，并计算各树脂的动态解吸率。结果见表7。

(4)

表7 不同型号大孔吸附树脂的筛选试验结果 %

从工艺角度出发，适宜的吸附树脂应具有良好的可逆性，即良好的吸附性能与解吸性能。根据实验结果可以看出，虽然AB-8的吸附能力没有D101的强，但是其解吸能力高于D101很多。综合评价，分离纯化桔梗茎叶总皂苷的最佳树脂可选择AB-8。

2.4.4 AB-8大孔吸附树脂纯化工艺参数

2.4.4.1 吸附因素的考察 上样量对吸附效果的考察：称取6份已处理好的AB-8树脂50 g，湿法装柱(径高比1∶7)，量取经离心处理的桔梗茎叶水提取液(每mL含桔梗茎叶提取物0.4 g)25、50、75、100、125、150 mL，以1.0 mL·min-1的流速进行动态吸附，吸附3 h后，收集过柱液，减压浓缩至干，按上述2.1方法，测定桔梗茎叶总皂苷的量，并计算不同上样量的吸附率，结果见图3。根据图3可知，随着上样量的增加，树脂的吸附率先上升后下降。上样量偏高，会造成树脂的过饱和不吸附，处理量小，上样量偏低，造成树脂的不完全利用，浪费资源。故50 g树脂上样100 mL药液比较适宜，则确定上样量为桔梗茎叶提取物量与树脂用量比为0.8∶1。

药液浓度对吸附效果的考察：称取6份已处理好的AB-8树脂50 g，湿法装柱(径高比1∶7)，量取经离心处理的桔梗茎叶水提取液100 mL，药液质量浓度分别为每mL含桔梗茎叶提取物0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g，以1.0 mL·min-1的流速进行动态吸附，吸附3 h后，收集过柱液，减压浓缩至干，按上述2.1方法，测定桔梗茎叶总皂苷的量，并计算不同药液浓度的吸附率，结果见图4。根据图4可知，吸附量随药液浓度的增大而增加，但吸附残液中桔梗茎叶总皂苷的含量也随药液浓度的增大而增加，从而引起成分的流失。药液浓度越大，吸附的杂质含量也越高，不利于总皂苷的分离纯化。因此，药液浓度选择每mL含桔梗茎叶提取物0.4 g为最佳，总皂苷的吸附量可达95%以上。

图3 上样量对吸附效果的考察结果

图4 药液质量浓度对吸附效果的考察结果

流速对吸附效果的考察：称取4份已处理好的AB-8树脂50 g，湿法装柱(径高比1∶7)，量取经离心处理的桔梗茎叶水提取液(每mL含桔梗茎叶提取物0.4 g)100 mL，分别以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL·min-1的流速进行动态吸附，吸附3 h后，收集过柱液，减压浓缩至干，按上述2.1方法，测定桔梗茎叶总皂苷的量，并计算不同流速的吸附率，结果见图5。由图5可知，0.5、1.0 mL·min-1的流速的吸附率变化不大，1.5、2.0 mL·min-1的流速的吸附率明显下降。由于流速过慢，耗时增加，效率降低。综合各因素考虑，控制流速为1.0 mL·min-1为宜。

图5 流速对吸附效果的考察结果

2.4.4.2 洗脱条件的优化 洗脱液浓度的考察：称取5份已处理好的AB-8树脂50 g，湿法装柱(径高比1∶7)，量取经离心处理的桔梗茎叶水提取液(每mL含桔梗茎叶提取物0.4 g)100 mL，控制流速为1.0 mL·min-1。先用蒸馏水将已吸附饱和的树脂柱洗至流出液接近于无色，再分别用35%、55%、75%、95%乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，减压浓缩至干，计算桔梗茎叶总皂苷提取物的收率，按上述2.1方法，测定桔梗茎叶总皂苷和桔梗皂苷D的含量，结果见表8。75%、95%乙醇的洗脱效果最好，55%乙醇洗脱次之，35%的洗脱能力最弱。其中，75%乙醇洗脱部分总皂苷和桔梗皂苷D的含量较95%乙醇高，说明75%乙醇可以将样品中的皂苷类成分全部洗脱下来，且杂质比95%乙醇少，因此选用75%乙醇作为洗脱剂。

表8 洗脱液浓度的考察结果

洗脱液体积的考察：称取5份已处理好的AB-8树脂50 g，湿法装柱(径高比1∶7)，量取经离心处理的桔梗茎叶水提取液(每mL含桔梗茎叶提取物0.4 g)100 mL，控制流速为1.0 mL·min-1。先用蒸馏水将已吸附饱和的树脂柱洗至流出液接近于无色，再分别用3、4、5、6、7、8 BV的75%乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，减压浓缩至干，计算桔梗茎叶总皂苷提取物的收率，按上述2.1方法，测定桔梗茎叶总皂苷和桔梗皂苷D的含量，结果见表9。5 BV的75%乙醇洗脱液就可以把树脂上80%以上的总皂苷解吸下来，故确定洗脱液为5 BV的75%乙醇。

表9 洗脱液体积的考察结果

综合以上试验结果分析，优化桔梗茎叶总皂苷纯化工艺参数：最佳工艺提取药液离心后浓缩至1.0 g生药/mL，通过AB-8型大孔吸附树脂，上样量为桔梗茎叶提取物量：树脂用量=0.8∶1，流速为1.0 mL·min-1，用5 BV的75%乙醇洗脱。

2.5 桔梗茎叶总皂苷提取纯化工艺验证试验

称取桔梗干燥茎叶3份，每份100 g，加10倍量的水提取2次，提取温度100 ℃，每次1.5 h，提取液减压浓缩至每mL含桔梗茎叶提取物0.4 g，离心后上清液上AB-8型大孔吸附树脂，上样量为桔梗茎叶提取物量∶树脂用量=0.8∶1，流速1.0 mL·min-1，先用蒸馏水将已吸附饱和的树脂柱洗至流出液接近于无色，用5 BV75%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压干燥，计算桔梗茎叶总皂苷提取物的收率，测定桔梗茎叶总皂苷和桔梗皂苷D的含量，结果见表10。由结果可知，桔梗茎叶总皂苷的平均得率为9.06%，总皂苷的平均质量分数为48.18%，桔梗皂苷D的平均质量分数为9.18 mg·g-1，说明该提取工艺稳定、可行。

表10 纯化验证试验结果

3 讨论

桔梗茎叶为中药桔梗的非药用部位，本研究以桔梗茎叶为原料，以桔梗茎叶总皂苷含量、桔梗皂苷D含量为指标，采用正交设计优化其最佳提取工艺，并进一步采用大孔吸附树脂技术优化了桔梗茎叶皂苷的分离纯化工艺，所得桔梗茎叶总皂苷的质量分数为48.18%，桔梗皂苷D的质量分数为9.18 mg·g-1，较大孔吸附树脂纯化前样品中总皂苷和桔梗皂苷D的含量提高5倍以上，为桔梗茎叶总皂苷进一步的药效及机制研究奠定了基础，也为合理利用桔梗资源与综合开发利用提供参考。