核桃楸叶降血糖和抗氧化有效部位的筛选及其成分分析△

王会，刘汇，张楠茜，张辉*，高文义*，孙佳明

1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.吉林省延边朝鲜族自治州食品药品检验所，吉林 延吉 133000

核桃楸叶是胡桃科胡桃属植物核桃楸JuglansMandshuricaMaxim.的树叶。原植物核桃楸，又名胡桃楸[1]，落叶乔木，生长在中国东北、华北、河北等地区[2-3]，其青果皮、茎、叶和树皮均可入药[4]。糖尿病是近年来发病率迅速增加并严重危害人类健康的疾病之一，糖尿病分为1型糖尿病和2型糖尿病，后者是最常见的，占糖尿病患者的90%以上[5-6]。α-葡萄糖苷酶抑制剂对餐后高血糖和高胰岛素血症有良好的防治效果，用于治疗由碳水化合物代谢紊乱而引起的疾病；α-淀粉酶抑制剂对唾液淀粉酶和胰液淀粉酶活性具有良好的抑制作用，阻碍食物中碳水化合物的代谢，降低体内的血糖和血脂水平，防止餐后高血糖[7-8]。

近年来对核桃楸其他部位的研究报道较多，但是对核桃楸叶的研究报道较少。本文建立了α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶体外抑制和DPPH自由基清除模型[9-10]，用于研究核桃楸叶乙醇提取物不同极性萃取部位对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用和DPPH自由基清除活性，并采用紫外分光光度法测定总黄酮含量，筛选核桃楸叶降血糖和抗氧化有效部位，超高效液相色谱法(UPLC)分析确定其活性成分，为研究其药理作用奠定基础，对核桃楸叶的开发和应用具有指导意义[11]。

1 材料

1.1 药材

核桃楸叶药材采于吉林省通化市，由长春中医药大学张辉教授鉴定为核桃楸JuglansmandshuricaMaxim.的干燥叶。

1.2 试剂与仪器

α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、维生素E、阿卡波糖(Sigma，美国)，对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(PNPG，Sigma，美国)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Sigma，美国)；维生素C(Sigma，美国)；对照品芦丁(纯度≥98%)、金丝桃苷(纯度93.3%)、异槲皮素(纯度≥98%)和紫云英苷(纯度>99%)，均购自中国食品药品检定研究院；其余试剂均为分析纯。Agilent 1260 Infinity(美国安捷伦公司)；BP211D型十万分之一电子天平(赛多利斯仪器有限公司)；酶标仪(Bio-Rad)；KQ3200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；紫外-可见分光光度计(Varian公司)；DSHZ-300A型旋转式恒温振荡器(太仓市实验设备厂)；96孔板；各种型号移液枪及枪头等。

2 方法与结果

2.1 核桃楸叶各部位的提取与分离

称取适量的核桃楸叶，置于圆底烧瓶中，先用90%的乙醇水溶液回流提取1次，再用70%的乙醇水溶液回流提取2次，料液比均为1∶10，每次1 h，滤过，合并提取液。回收乙醇，减压浓缩。取500 mL核桃楸叶乙醇提取液，挥至无醇味，剩余350 mL，取100 mL留为总提(A)，剩余的250 mL依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，获得不同溶剂萃取部位，依次标记为B、C、D，萃取后溶液作为水层(E)，萃取方法为等体积萃取3次。收集各层萃取液，减压浓缩、干燥至干膏，作为供试药物[12]。

2.2 测定核桃楸叶不同萃取部位(A～E)对α-葡萄糖苷酶抑制活性

根据已有方法改进[13-14]，检测在96孔板上进行，先加入20 μL不同浓度样品，再加入40 μL 0.5 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶，37 ℃恒温振荡孵育5 min；加入20 μL 3 mmol·L-1的底物PNPG，37 ℃恒温振荡孵育15 min，最后加入100 μL 0.1 mol·L-1Na2CO3，立即测定405 nm处的吸光度(A)值[15]。每个浓度样品同时进行3个平行测定并取平均值。实验均设定空白对照、背景对照、阴性对照，按公式(1)计算抑制率，并计算相应的IC50值，A～E的α-葡萄糖苷酶抑制活性如表1所示。

(1)

2.3 测定A～E对α-淀粉酶抑制活性

应用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定α-淀粉酶活性[17]，反应体系为0.2 mL的α-淀粉酶溶液，在37 ℃下预热5 min后，加入0.4 mL淀粉溶液和0.2 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在37 ℃下反应30 min。反应完成后加入2 mL DNS，在沸水中反应10 min，取出，冷却，取0.5 mL反应溶液置于5 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，用紫外可见分光光度计测定540 nm处的A值，实验均设有样品、背景对照、空白和空白对照。按公式(2)计算抑制率，并计算相应的IC50值。反应体系见表2，抑制率结果见表3。

(2)

表2 A～E对α-淀粉酶活性反应体系

注：—表示用同体积蒸馏水代替。

表3 A～E对α-淀粉酶抑制活性

2.4 测定A～E对DPPH自由基清除活性

采用DPPH法[17-18]对分离得到的核桃楸叶乙醇提取物进行体外抗氧化活性评价。精密量取2 mL质量浓度为26.4 mg·L-1的DPPH甲醇溶液，再分别加入2 mL不同浓度的用甲醇溶液制备的样品液，混合均匀，避光条件下反应30 min，测定其在517 nm处的A值[15，19]。同时，用2 mL甲醇溶液代替样品溶液作为空白对照，将2 mL样品溶液与2 mL甲醇溶液混合作为样品对照，将维生素E作为阳性对照，按公式(3)计算样品液对DPPH溶液清除率。

(3)

式中：Ai为与待测溶液混合后的DPPH溶液的吸光度；Aj为与待测溶液混后的溶剂的吸光度；A0为溶剂和DPPH溶液混后的吸光度。

A～E的DPPH清除率如表4所示，结果可知，C的清除率远高于其他4个部位，因此，C对DPPH自由基清除活性最好，表明C是核桃楸叶抗氧化的有效部位。

表4 A～E的DPPH自由基清除活性

2.5 A～E的总黄酮含量测定

运用紫外分光光度法[20]，精密称取11.5 mg(于105 ℃干燥至恒重的)芦丁对照品，置于50 mL容量瓶中，先加入适量60%乙醇水溶液超声溶解，再用适量的60%乙醇水溶液稀释定容，制得芦丁对照品溶液(0.20 mg·mL-1)。精密吸取上述芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加入0.4 mL 5% NaNO2溶液，混合均匀，静置6 min，加入0.4 mL 10% Al(NO3)3溶液，混合均匀，静置6 min，加入4.0 mL 4% NaOH溶液，最后用50%乙醇水溶液稀释至刻度，混合均匀，静置15 min[21]。将50%乙醇水溶液作为空白对照，运用紫外分光光度法，测定512 nm处不同质量浓度芦丁对照品溶液的A值。以A值为纵坐标(Y)，以芦丁对照品溶液的质量浓度为横坐标(X)进行线性回归，制备标准曲线，得回归方程为Y=0.654 3X-0.061 1(r=0.999 5，n=3)，结果表明，芦丁质量浓度在0.23～1.15 mg·mL-1呈良好的线性关系。

吸取适量的A～E样品液置于不同的容量瓶中，依上述方法，测定其512 nm处的A值，将不加供试品的样品作为空白。结合标准曲线计算供试品中总黄酮的含量，结果如表5所示。

表5 A～E的总黄酮含量测定结果

2.6 UPLC分析

分析条件：Agilent SB-C18色谱柱(4.6 mm×100 mm，1.8 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min：5%～20% A；10～40 min：20%～23% A；40～45 min：23%～25% A；45～70 min：25%～25% A；70～75 min：25%～100%A；75～95 min：100%～100% A)。流速为300 μL·min-1，检测波长为254 nm，柱温为25 ℃，溶液均为1 mg·mL-1。混合标准品进样体积为5 μL，乙酸乙酯样品进样体积为13 μL。色谱图显示有3个黄酮类成分的标准品与样品对应峰的保留时间一致，表明样品中存在金丝桃苷、异槲皮素和紫云英苷(见图1)。

注：A.对照品；B.核桃楸叶乙酸乙酯样品；1.金丝桃苷；2.异槲皮素；3.紫云英苷。图1 核桃楸叶及对照品HPLC图

3 讨论

核桃楸叶乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有一定的抑制作用，对DPPH具有清除作用，但没有具体深入的研究报道。因此，通过建立α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的体外抑制模型，测定DPPH自由基清除活性和总黄酮含量，进行UPLC分析，筛选核桃楸叶的降血糖和抗氧化的有效部位及活性物质。对核桃楸叶各部位进行α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的体外抑制活性以及DPPH清除活性的实验，结果表明核桃楸叶乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位在体外对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有明显的抑制作用，其IC50分别为0.014、0.13 mg·mL-1，而阳性药阿卡波糖的IC50分别为0.044、0.158 mg·mL-1，其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用均强于阳性药阿卡波糖；其乙酸乙酯萃取部位比其他萃取部位具有更明显的DPPH自由基清除能力，其IC50为6.89 mg·mL-1，应该是核桃楸叶的降血糖和抗氧化有效部位；乙酸乙酯活性部位中总黄酮质量分数为86.11%，是该部位的主要成分，其有效成分是金丝桃苷、异槲皮素和紫云英苷。通过本实验，可以初步确定该活性部位中主要活性物质为黄酮类化合物，且主要活性成分是金丝桃苷、异槲皮素和紫云英苷。该研究为进一步研究核桃楸叶的药理作用打下坚实基础，也为深入研究核桃楸叶的应用价值提供理论支持。