苦参实毒性成分分析△

宿美凤，雒晓梅，常晓燕，王小明，孙虹，李壮壮，石钺*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 100029；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

苦参Sophoraflavescens为豆科槐属植物，传统中药苦参的药用部位为根。近年来，随着中医药事业的快速发展，中药非药用部位引起了越来越多的研究者的关注。本实验室整理发现，苦参实为豆科槐属植物苦参的种子。《唐本草》正名为苦参实，至《本草纲目》标明异名苦参子，可为药用，性味苦寒，功能与主治：明目，健胃与驱虫，善治急性菌痢，大便秘结等[1]。苦参实曾被收录于1977版吉林省药品标准[2]，《中医验方集锦》和《中医皮肤病学简编》记载苦参实用于治疗肉疙瘩和青年扁平疣[3-4]，此外还有民间报道：王国栓将苦参实干燥粉碎装入胶囊，临床治疗扁桃体炎患者41例，痢疾湿热型18例，阴道滴虫20例，均在服药3～10 d治愈[5]。近年来对苦参实的研究较少，文献报道苦参实中含有高含量的生物碱类物质和丰富的脂肪酸类物质，并且苦参实脂肪酸提取物具有良好的抗氧化作用[6]。但是有文献报道，一名男性患者由于痔疮反复发作，自服苦参子仁20粒，当晚发生神经系统中毒症状，经抢救康复[7]。因此本试验通过苦参实的单次给药毒性试验对苦参实毒性成分进行初步研究，为苦参实今后的开发利用提供依据。

1 材料与试剂

药材：苦参实购于内蒙古赤峰，经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定为豆科槐属植物苦参Sophoraflavescens的成熟种子。

实验动物：SPF级 Wistar 大鼠，雌雄各半，体质量180±20 g，购自北京市维通利华实验动物技术有限公司，许可证号 SCXK(京)2016-0006，饲养于中国医学科学院药用植物研究所 SPF 动物实验中心(20～25 ℃，湿度40%～60%)，开展实验前适应性饲喂一周，自由饮水进食。

对照品：苦参碱(批号CHB-K-008)、氧化苦参碱(批号CHB-Y-053)、槐定碱(批号CHB-H-062)购自成都克洛玛生物科技有限公司，槐果碱(批号MUST-17061205)购自成都曼斯特生物科技有限公司，氧化槐果碱(批号Z18S6B3547)购自上海源叶科技有限公司，N-甲基金雀花碱(批号J-032-161216)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。HPLC测定对照品纯度均>98%。

试剂：95%乙醇购于北京化工厂。HPLC级乙腈购于Honeywell Burdick & Jackson公司。色谱级甲酸购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。色谱级醋酸胺购于ROE SCIENTIFIC INC公司。娃哈哈纯净水购于杭州娃哈哈集团有限公司。001×7型阳离子交换树脂购于天津南开大学化工厂。

对照品的配制：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱、N-甲基金雀花碱配制浓度为1 mg·mL-1的对照品储配液，备用。

仪器：Agilent 1100 高效液相色谱仪，ES-1201-P 电子天平称(1200 g，长沙湘平科技发展公司)，Mettler Toledo AB135-S 型分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)，KQ-250DE 超声波清洗仪(中国)，Eppendorf 移液器(德国)。

2 方法与结果

2.1 苦参实总提取物的制备

苦参实适度粉碎(过20目筛)，95%乙醇水热回流提取三次，每次1 h，过滤收集滤液，合并三次滤液，旋转蒸发仪旋干溶剂，真空干燥既得苦参实提取物，备用。

2.2 苦参实提取物不同组分的制备

阳离子交换树脂按照说明书进行预处理，处理好的树脂湿法装柱(柱径∶柱高=1∶8)，经预实验结果得，取100 g苦参实提取物用酸水溶解少量多次，至酸水液无碘化铋钾反应，酸水上样吸附1～2 h，4倍柱体积去离子水洗脱至洗脱液近中性。再用14倍柱体积的5%氨性乙醇洗脱至洗脱液浓缩后无碘化铋钾反应。分别将水洗部分和氨性乙醇洗脱部分减压回收溶剂得到相应的组分。

2.3 苦参实总提物单次给药毒性试验

表1 苦参实总提物单次给药毒性预实验结果

表2 苦参实总提物单次给药毒性试验结果

表3 苦参实总提物单次给药毒性试验雄性动物体质量的变化 g

表4 苦参实总提物单次给药毒性试验对雌性动物体质量的影响 g

2.4 经HPLC鉴定苦参实不同组分

2.4.1 供试品的配制 称取2.1，2.2项下苦参实总提物及不同组分各自溶于50%甲醇水溶液中配制成10 mg·mL-1，涡旋超声后，12 000 r·min-1离心10 min，取10 μL经HPLC分析。

2.4.2 对照品的配制 取材料与试剂项下对照品母液，混合配制成混标。

2.4.3 HPLC条件 液相条件：采用Phenomenex Gemini C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)和 10 mmol·L-1醋酸铵水溶液(B)；梯度洗脱条件：95%～83% B(0～6 min)，83% B(6～14 min)，83%～70% B(14～19 min)，70%～68% B(19～32 min)，68%～65%(32～35 min)，65%～0(35～40 min)，0～95%(40～43min)，95%(43～50 min)；流速：1 mL·min-1；进样体积：10 μL；自动进样器温度：室温；色谱柱温度：30 ℃；检测波长：225 nm。

2.4.4 样品分析 各组分色谱图见图1。由图可知阳离子交换树脂水洗部分为非生物碱部分，氨性乙醇洗脱部分与混标色谱信息相匹配，所以氨性乙醇洗脱部分为生物碱部分。

注：A.混标；B.苦参实总提物；C.生物碱部分；D.非生物碱部分。图1 苦参实不同组分HPLC色谱图

2.5 苦参实不同组分的单次给药毒性试验

苦参实不同组分单次给药毒性试验结果见表5，体质量变化见表6及表7。结果发现生物碱组与总提物组出现动物死亡，并且动物出现死亡的现象、症状以及体质量变化均与2.3项下描述相似，死亡动物进行大体解剖无肉眼可见病变。而非生物碱组未出现死亡，无任何中毒症状，并且非生物碱组体质量增长与溶剂对照组相似。生物碱组与总提物组在给药后1～3 d体质量增长明显缓慢而非生物碱组给药后1～3 d体质量增长正常。虽然生物碱组动物死亡率低于总提物组，可以说明生物碱类物质是引起苦参实急性毒性的主要原因。

表5 苦参实不同组分单次给药毒性试验结果

3 讨论

通过本试验可知苦参实有毒，研究者通过对苦参实化学成分的文献检索分析，通过阳离子交换树脂分离苦参实中的生物碱部分和非生物碱部分，并通过HPLC 验证阳离子交换树脂可以将生物碱和非生物碱良好分离。

由试验结果可知苦参实的主要毒性成分为生物碱类物质。

根据本试验所观察到的急性毒性反应症状，参照药物单次给药毒性研究指导原则中的一般观察与指征，苦参实提取物引起的惊厥，肌肉震颤和强直性痉挛等毒性症状为神经毒性症状。并且中毒症状与文献报道苦参、苦参碱和氧化苦参碱的急性毒性症状相似[9-11]。翁泽斌等[12]报道的山西产苦参种子生物碱类化学成分定性定量分析表明苦参实中含有大量生物碱类物质，氧化苦参碱含量最高，本实验室也得到相似结论(待发表)。在中药化学成分的研究过程中发现生物碱类物质具有良好的药理活性，同时如果大量使用也会产生毒性。现代研究表明，苦参中所含的生物碱类物质是其主要的有效成分[13-14]。因此，也验证了本试验通过苦参实总提物单次给药毒性试验以及苦参实的不同组分的单次给药毒性试验得到的结果，引起苦参实急性毒性的主要原因为生物碱类。但是从动物死亡数可知，生物碱组引起死亡的动物数低于总提物组，其产生原因可能是由于动物个体差异、生物碱种类含量不同以及生物碱累积作用或者苦参实中含有其他非生物碱物质对于苦参实中生物碱引起的毒性具有协同作用，也可能是其他原因，还有待深入研究。

表6 苦参实不同组分单次给药毒性试验对雄性动物体质量的影响 g

表7 苦参实不同组分单次给药毒性试验对雌性动物体质量的影响 g