单核苷酸多态性微阵列技术在圆锥动脉干畸形胎儿诊断中的运用

林美芳，郑 菊，雷 婷，杜 柳，谢红宁

（中山大学附属第一医院超声科，广东广州 510058）

圆锥动脉干畸形（conotruncal defects，CTD）是一类流出道异常的复杂型心血管畸形，占先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）的20%～30%［1］，通常包括法洛四联征、大动脉转位、共同动脉干、右室双出口等。先天性心脏病的病因和发病机制复杂，大量的临床、流行病学及胚胎学的研究表明基因异常在先心病的发生中起到一定的作用［2］。近年来染色体微阵列分析方法（chromosomal micro array CMA）运用于心脏病拷贝数变异检测也进一步证实了这一点［3-4］。然而，不同的亚型有其特定的基因变化机制，圆锥动脉干畸形作为心脏畸形的一种重要亚型，目前对其发生基因机制了解甚少［5］。为此，本研究运用单核苷酸多态性微阵列方法对一组相对大样本的合并圆锥动脉干异常胎儿进行拷贝数变异分析，以阐明其发生的可能机制，有助于早期诊断，早期干预。

1 材料与方法

1.1 研究对象

来自2013年1月至2018年3月在中山大学附属第一医院行产前常规筛查的孕妇及外院来会诊的病例，其中明确诊断胎儿CTD的孕妇145例纳入研究。本研究通过本院伦理委员会批准。所有病例已签署知情同意书。

1.2 胎儿结构异常的检查与追踪

对怀疑心脏异常胎儿，进一步行胎儿超声心动图检查，按照国际妇产超声胎儿超声心动图指南，由两位具有10年以上工作经验的专家共同初步诊断，同时识别心内，心外畸形［6］。所使用机器为Voluson E6/E8。对所有病例进行追踪，以获取出生后的超声心动图、手术记录，或尸解结果进一步明确诊断。

1.3 胎儿染色体及基因检测

实时荧光定量PCR（real time quantify QFPCR）及单核苷酸多态性微阵列技术用于测量染色体单体及染色体微重复及微缺失，其中QFPCR可于48 h出结果。当QF-PCR结果为常见染色体非整倍体，如21三体、18三体及13三体等时，则病例被排除，不再进一步分析；如果QF-PCR结果正常，则进一步行单核苷酸多态性微阵列技术检测。检测采用Affymetrix Cytoscan 750 K Array芯片（美国Affymetrix公司产品），该芯片包含750 000个单核苷酸多态性位点，分辨率≥100 kb。步骤严格按照操作手册进行。芯片结果依据查询文献及根据 DGV（http：//dgv.tcag.ca/dgV/app/home）、Decipher（https：//decipher.sanger.ae.uk/）、在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）数据库对检出的变异进行综合分析，将拷贝数变异（copy number variations，CNV）分为病理性、临床意义不明、良性3类。根据CNV的临床意义，将病例分为非良性组（病理性CNV+不明意义CNV）和良性组（无CNV+良性CNV）。

1.4 统计分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。不服从正态分布的定量资料采用中位数和四分位数间距描述，组间比较采用秩和检验；定性资料采用频数和构成比描述，组间比较采用卡方检验，当理论频数＜5时采用Fisher精确概率法。检验水准ɑ=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

研究期间共145例胎儿确诊为圆锥动脉干异常，其中17例的QF-PCR结果异常（7例18三体，5例21三体，2例13三体，3例性染色体非整倍体）而被排除。剩余128例QF-PCR结果正常的胎儿进一步分析其超声特征及拷贝数变异情况。此128例病例包括法洛四联征（n=58）、右室双出口（n=44）、共同动脉干（n=15）、大动脉转位（n=11）。孕妇的中位数年龄30（19～46）岁，中位数孕龄23（15～31）周。128例病例中，父母选择终止妊娠81例，胎死宫内4例，出生后死亡5例，因此共38例胎儿存活，目前19例已手术，总体术后效果良好。

2.2 胎儿结构异常

128例病例中，60例（46.9%）合并心外异常，70例（54.7%）合并心内异常。60例合并心外异常的病例包括28例（46.7%）合并单纯结构异常，21例（35.0%）合并单纯软指标异常，11例（18.3%）胎儿同时合并结构及软指标异常，常见合并的结构异常为：异构综合征16例（26.7%），骨骼系统异常6例（10.0%），胸腺异常5例（8.3%）；最常合并的软指标异常为：鼻骨缺失12例（20.0%），单脐动脉9例（15.0%），枕后皮层增厚6例（10.0%）。在70例合并心内异常胎儿中，常见为：持续性左上腔静脉（n=22，31.4%），动脉导管缺如（n=17，24.3%），房室间隔缺损（n=16，22.9%）。

2.3 胎儿染色体及基因检测

128例CTD胎儿中CNV检出率为14.1%（18/128），其中包括病理性CNV为5.5%（7/128）、临床意义未明CNV为4.7%（6/128）和良性变异CNV为3.9%（5/128）。因此较之染色体检查CMA检查发现了额外5.5%病理性CNV，包括22q11.21微缺失3例及其他少见病理性CNV 4例。此4例病例其CNV均包含与心脏畸形相关的基因：1例为右侧异构综合征胎儿（病例No.103），其心脏畸形为右室双出口，在染色体14q11.2区域存在1.8 Mb微缺失，此区域的缺失包含基因PRKD1和NKX2-6；1例法洛四联征无合并其他结构畸形的胎儿（病例No.51）在染色体8p23区域存在219 kb微缺失，此缺失包含MYOM2基因，1例右室双出口合并耳发育不良畸形（病例No.88），其染色16p13.3存在微重复，该区域包含AXIN1基因，1例右室双出口病例（病例No.104），在16p11.2存在微缺失，该区域包含CACNA1C基因。7例病理性CNV和6例不明意义CNV病例的具体基因型及表型情况（表1）。

根据CNV的临床意义，将128例病例分为良性CNV组（n=115）及非良性CNV组（n=13），非良性CNV组病例合并心外总异常率（76.9%vs.43.5%，P=0.037），结构性心外异常率（61.5%vs.24.2%，P=0.022）、软指标的异常率（61.5%vs.20.9%，P=0.004）及胸腺异常率（30.8%vs.0.87%，P=0.000）高于良性变异组。两组间除持续性左上腔静脉发生率（46.2%vs.13.9%，P=0.010）存在差异外，合并心内其他异常率无显著差异，4种圆锥动脉干异常的亚型间其非良性变异率无显著差异（P=0.530）。非良性组的自然死亡率（50%）高于良性组（16.4%），但未达统计学差异（表2）。

3 讨论

CTD是一组影响流出道而解剖结构不同先天性心脏病，最近对于青少年及成人圆锥动脉干异常拷贝数变异的研究偶见报道［7-9］，而对于产前的研究较少，本研究是目前为止样本量较大的研究，我们的结果发现病理性CNV检出率达5.5%，同时发现合并心外异常提示非良性的拷贝数变异发生率较高。因此临床工作中，需要仔细识别所合并的心外异常，将对判断是否需要进行介入性诊断有重要指导意义。

在所有拷贝数变异中，合并22q11.2微缺失或微重复已被多次报道［10-11］。本组病例中，22q11.2微缺失或微重复发生率2.3%（3/128），除2例病例为经典的微缺失（病例No.8及病例No.114）外，1例（病例No.86）的微缺失为非典型缺失，此病例为右室双出口合并单脐动脉，缺失27 kb，包含了CLTCL1基因，此基因来源于父亲，父亲除外一些面部特征如明显颧骨平坦，没有明显的表型。胎儿的父母选择了引产，胎儿尸解结果证实右室双出口诊断，胸腺缺如，考虑到22q11微缺失的分子机制的复杂性［10-13］，我们认为此病例存在病理性的拷贝数变异。

其他非少见的致病性CNV也被报道与先心病有关，例如位于1q21.2，11q及9q34区域的CNV；在我们的研究中，有4例非22q11区域的致病性CNV被检出。1例心脏畸形为右室双出口的右侧异构综合征的胎儿（病例No.103）在染色体14q11.2区域存在1.8 Mb微缺失，此区域的缺失包含基因PRKD1和NKX2-6，其中NKX2-6是TBX1信号通路下游基因，在圆锥动脉干分隔形成过程中起到重要作用［14］。而PRKD1基因是有别于TBX1基因另一与圆锥动脉干异常有关的单基因，最近被报道其作用机制是通过调节基因MEF2，从而在圆锥动脉干异常发生重要作用［15］。另一例法洛四联征胎儿（病例No.51）在染色8p23区域存在219 kb微缺失，此缺失包含MYOM2基因，另外两例右室双出口病例，分别在染色体16p13.3存在微重复，16p11.2存在微缺失，所包含AXIN1，CACNA1C基因均与心脏结构异常有关［16］。

表1 病理性或临床意义未明拷贝数变异的13例胎儿的基因型及表型Table 1 Phenotype and genotype of 13 cases with pathogenic or VOUS CNV

表2 良性组与非良性组临床特征及结局比较Table 2 Comparison of prenatal characteristics and outcomes between fetuses with non-benign CNV and those with benign CNV ［n（%）］

本研究结果表明，圆锥动脉干畸形胎儿若合并心外异常提示其合并非良性的CNV可能性大，而所合并心内异常发生率与非良性CNV结果没区别，此结果与其他成人心脏病的拷贝数变异的研究结果相似，Khoshnood［17］指出检测心外异常对先天性心脏病的发生的原因、机制、时间点的研究提供线索，因此在临床工作中，必须仔细识别可能合并的心外异常，将有助于决定该病人是否需要介入性诊断。在先心病的研究中，发现合并基因的异常胎儿预后不良［18］。我们的研究也发现非良性组的自然死亡率比良性组高，但是未达统计学差异，这可能与本组病例引产率高而影响结局分析有关。

本研究存在一定的局限性：首先本组病例的引产率较高，影响了胎儿预后及基因表型的分析；其次并非所有胎儿父母同时做CMA的检测，因此不利于对临床意义未明的CNV的解读。最后，此研究为回顾性分析，存在本身的局限性，期待大样本的前瞻性的进一步阐释胎儿圆锥动脉干畸形的可能基因机制。

总之，本研究证实了拷贝数变异是圆锥动脉干畸形的可能发生机制之一，我们建议对合并圆锥动脉干畸形胎儿的产前超声诊断过程中，重视对包括胸腺异常在内的心外异常的仔细检查，这将有助于指导临床是否进行介入性诊断。